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固体进入无菌室步骤：． 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。2． 关灯后0?5小时后放可进入。3． 进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤：1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中。11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样。12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）。13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中 ，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。。14， 再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准）。15， 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。。16， 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
复红亚硫酸钠培养基(远藤氏培养基)、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白胨培养液、三倍浓乳糖蛋白胨培养液、伊红美蓝培养基(EMB 培养基)。
微孔滤膜(孔径0.45?m)、滤器(容量500mL)、抽气设备、镊子、发酵用试管、杜氏小管、培养皿、刻度吸管或移液管、接种环、酒精灯。
操作步骤
(一)水样的采集：1．自来水 将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙头流水5min， 以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。2．池水、河水或湖水 将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于冰箱，但不能超过24h。
(二)滤膜法检测大肠菌群：l．用无菌镊子将一无菌滤膜置于滤器的承受器当中，将过滤杯装于滤膜承受器上，旋紧，使接口处能密封，将真空泵与滤器下部的抽气口连接(图26-1)。2．加水样100mL于滤杯中，启动抽真空系统，使水通过滤膜流到下部，水中的菌细胞被截留在滤膜上。水样用量可适当增减使获得菌落适量。3．用无菌镊子小心将截留有细菌的滤膜取出，平移贴于复红亚硫酸钠固体培养基上(注意无菌操作，滤膜与培养基间贴紧，无气泡)，37℃培养16～l8h。挑选深红色或紫红色、带有或不带金属光泽的菌落，或淡红色、中心色较深的菌落进行涂片和革兰氏染色观察。4．经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，再接种在乳糖蛋白胨半固体培养基上，37℃培养6～8h后观察，产气者证实为大肠菌群阳性。培养中应及时观察，时间过长则气泡可能消失。
5．结果计算：水样中总大肠菌群数/个?L-1=（滤膜生长的菌落数/过滤水样量/mL）×100（滤膜上菌落数以20～60个/片较为适宜）
多管发酵法检测大肠菌群
1．取5支装有3倍浓乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样10mL。另取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入水样lmL。再取5支装有乳糖蛋白胨培养基的初发酵管，每管分别加入按1：10稀释的水样lmL（即相当于原水样0.1mL），均贴好标签。此即为15管法，接种待测水样量共计55.5mL。各管摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
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