巧克力平板培养基是一种微生物培养基，在医学和生物研究等方面已经被广泛使用。巧克力平板主要是用于奈瑟氏菌属和嗜血杆菌等需氧菌的分离和培养。主要是蛋白胨和牛肉粉用来提供细菌生长所需的碳源、氮源氨基酸以及维生素。氯化钠维持培养基中的渗透压，琼脂用做凝固剂。脱纤维羊血提供氯化血红素和辅酶I，为嗜血杆菌属的生长提供特殊营养。
巧克力平板培养基还能够培养其他细菌，主要的原因还有血液中有V、X因子，这两种因子是位于红细胞中的，一般细菌不能利用，轻微的加热（一般为75~85摄氏度左右）使红细胞破坏释放到细胞外方可利用。
巧克力培养基用途主要用于嗜血杆菌的分离，亦可用于奈瑟菌的增菌培养。原理流感嗜血杆菌培养时，需要依赖血液中的X及V因子方能生长繁殖，当培养基加热至80～90℃时，可使血液中的红细胞破裂，以利于嗜血杆菌，奈瑟菌等的生长培养。凡疑有这些菌种存在的标本，均应接种巧克力平板。血液标本培养，增菌后又细菌生长，若移种巧克力平板上，有利于分离更多的细菌。成分牛肉浸出液1L蛋白胨10氯化钠5琼脂15无菌脱纤维马血、羊血或兔血100mlpH7.2～7.4
制备将前四项成分混合，加热溶化，校对pH，高压灭菌（121℃15min）后在80～90℃以无菌方法加入血液，摇匀后置90℃水浴中。维持该温度15min，使之呈巧克力色取出，至室温冷至约50℃，倾制平板 。凝固后，抽样置于35℃培养18～24h，如无细菌生长，冷藏备用。接种将可疑标本直接划线接种于该培养基上，置35℃普通培养或置含5%～10%二氧化碳环境培养18～24h，取出观察细菌生长状况。观察结果流感嗜血杆菌菌落微小(0.8mm),无色透明、光滑整齐、似露滴状，48h后达1.5mm，从血液或脑脊液中分离的菌落往往形成液状，菌落较大，老培养物菌落中心呈凹陷。质量控制流感嗜血杆菌ATCC10211，生长良好，菌落典型。肺炎链球菌，ATCC6305，生长良好，菌落典型。
保存置冰箱，1周内用完。
平板培养基制作方法如下：
① 将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。高压灭菌或干燥灭菌后备用。
② 取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，略打开灭菌过的培养皿盖(露一小缝)，倒入培养基(厚度为0.5cm)，封盖、冷凝，倒置备用。
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