熊果酸别名又叫做乌苏酸、乌索酸，是属于有机三萜酸。其熔点 在254-257 摄氏度，是 羟基酸，易溶于熊果酸溶于甲醇、乙醇、丁醇、丁酮、氯仿、丙酮等，不溶于水及石油醚。 味苦，有一定的光学活性，比旋光度 59（c=0.3，cyridine ）作用：近来研究还发现熊果酸是 很好的免疫增强剂,具有较强的免疫增强作用和抗致癌、抗促癌、诱导 F9 畸胎瘤细胞分化和 抗血管生成、抗将血清软氨酶、抗糖尿病等作用,且毒性小。所以熊果酸有望成为低毒有效 的新型抗癌药。另外还具有明显抗氧化功能，因而医药和化妆品原料、食品的乳化剂，具有 抗糖尿病作用。 熊果酸在药用植物中分布广泛,尤以枇杷叶中含量较高。枇杷叶是传统的常用中药 ,具有 止咳、清肺和胃、降气化痰之功效。研究表明,枇杷叶中含皂苷、苦杏仁苷、熊果酸、齐墩 果酸、丁香素、枸橼酸盐、鞣质、维生素 B1 和维生素 C 等。通过提取、分离、纯化等步骤 制得熊果酸,工艺简便易行,为熊果酸的工业化生产和综合利用枇杷叶资源提供了参考依据。
1 仪器与试剂 1.1 仪器 ES-C600 天平(湘仪天平仪器厂);超声波振荡仪(上海 Branson);RE-52 旋转蒸发仪 ;电热恒温水浴锅; TG16-Ⅱ台式离心机 (长 沙平凡仪器仪表有限公司);高效液相色谱仪(液相色谱仪用 HP agilent 1100,检测器用紫外可 见检测器, SEPU 色谱工作站 3000 )。
1.2 试剂 95%乙醇(武汉宏大化学试剂厂生产,分析纯,符合 GB679-94 标准);甲醇(天津市科 密欧化学试剂开发中心提供,色谱纯);石油醚(60~90℃,天津市科密欧化学试剂开发中心提供 ); 活性炭;熊果酸、齐敦果酸;枇杷叶,干燥,粉碎备用;水为蒸馏水、 离 子水。
2.1 提取 称取枇杷叶粉末[过 20 目筛, 100g 置于烧杯中,用 8 倍量 95%乙醇超声提取 3 次, 每次 30 min。合并 3 次提取液,过滤除去残渣,减压回收乙醇,得浸膏。 20 目筛 枇杷叶、粉碎、烘干 乙醇回流提取 趁热过滤 溶剂浓缩得浸膏 石油醚 24h 浸提 NaOH 溶液水洗 无水乙醇 洗出液（无色) 溶解 活性炭 过滤 热乙醇 放冷静置 结晶 白色片状 加热 热乙醇 重结晶 溶解 回流脱色 反复洗残渣 熊果酸粗品 高效液相
2.2 纯化 将浸膏依次用石油醚、1%氢氧化钠水溶液、水洗至洗出液近无色,烘干。再用无 水乙醇加热溶解,加活性炭回流脱色 20min,滤过。用热乙醇反复洗涤残渣 ,合并滤液及洗液, 蒸去部分乙醇,放冷,静置,得白色片状结晶;过滤,滤饼加入乙醇,加热煮沸,趁热过滤,滤渣反复 用乙醇重结晶得白色针状结晶。 图 1.提取熊果酸的原则工艺流程
2.2.1 大孔吸附树脂层析法 大孔吸附树脂是一类不含离子交换基团的交联聚合物，理化性质稳定，不溶于酸、碱 及有机溶剂，对有机物有浓缩、分离作用且不受无机盐及离子、低分子化合物的干扰。它的 吸附作用通过表面吸附、表面电性或形成氢键而完成。大孔吸附树脂与有机物的作用力主要 为范德华引力与氢键。 首次采用大孔吸附树脂富集柱和大孔吸附树脂纯化柱串联的方法分离 纯化熊果酸。富集柱优先吸附熊果酸以除去大量杂质，使熊果酸的纯度从 28.05%提高到 85.0%以上，再用纯化柱除去熊果酸中的部分杂质，使熊果酸的纯度进一步提高到 95.0%以 上。分步洗脱富集柱时发现，50%以下的乙醇溶液可以有效除去杂质，而熊果酸则可用 pH 为 10 的 80%乙醇溶液解吸，解吸率为 98.0%以上。在 pH 为 10 的 80%乙醇溶液中，纯化柱 对杂质的吸附率为 98.76%，而对熊果酸的吸附率仅为 0.05%。 洗脱剂组合，即水一 20%乙醇一 50%乙醇一 52%乙醇一 80%乙醇(pH=10)，每一段洗 脱剂的体积分别为:50，50，150，100，100ml。将富集柱熊果酸的解吸过程与纯化柱杂质的 吸附过程串联即可达到纯化熊果酸的目的。富集柱和纯化柱再生容易，经过再生后，树脂的 吸附率均可恢复到 98%以上;大孔吸附树脂技术以其独特的优势广泛用于中草药化学成分的 分离纯化，主要用于水溶性物质的分离，如水溶性生物碱、黄酮类化合物、昔类化合物、皂 昔类化合物、多酚类或酸性化合物、糖类、维生素、色素等。
2.3 高效液相色谱法 高效液相色谱用于熊果酸分离测定具有快速、高效、操作方便等优点。用于熊果酸分析 的高效液相色谱柱的固定相为 C18，即十八烷基键合相硅胶，流动向以甲醇一水体系为主。 甲醇与水的比例变化较大，从 80:20~97:3 不等。采用甲醇一磷酸盐缓冲液为流动相，熊果 酸进样量在 0.251 一 10.0409 呈良好的线性关系，最小检出限 (信噪比 )3)为 0.1509(HP 一 1050DAD 检测器)。HPLC 法检测器大多使用紫外检测器，检测波长在 210~220nm 之间。熊 果酸甲醇溶液紫外吸收的最大波长为 204nm， 但甲醇在此波长下亦有很强的背景吸收，为减 少干扰，一般选择 215lun~220nln 作为熊果酸的检测波长。HPLC 法测定熊果酸的含量已经 得到长足的发展，采用调节流动相的 pH 值和加入盐等手段以改善色谱峰峰形和分离度，提 高检测灵敏度和准确度。
总之，HPLC 法用于熊果酸测定具有快速、高效和操作方便等优点，因此，本研究选用 HPLC 法作为分析检测手段。 ①色谱条件: 色谱条件:Hypersi1C: ，色谱柱(250nunx4.6mm，10 腼);流动相:甲醇一水一磷酸 二氢钠一二乙胺(88:12:0.20:0.02(v/v));流动相用微滤膜过滤后，超声脱气处理 20min;检测波 长入=220nm;流速 0.5ml/min;柱温为 25℃，检测灵敏度为 0.04。 ②对照品标准样品溶液的配制:精密称取熊果酸对照品用甲醇配制成浓度为 1mg·mL-1 的对 照品溶液， 摇匀， 再做梯度稀释为 20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1，125μg·mL-1 的熊果酸标准样品。一进样量为横坐标、 峰面积为纵坐标，电脑绘制标准曲线，其回归方 程：Y=19.22652X-18.19440,R=0.99904. ③提取溶液的配制:精密称取 0.229g 结晶Ⅰ,甲醇溶解并定容至 25 mL,得供试品 1。精密量取 供试品 1 及对照品溶液混合。 ④高效液相分析:分别精密量取对照品溶液、供试品 1,在上述色谱条件下进行高效液相色谱 分析,在保留时间为 17. 292 min 处出现一单峰。 用面积归一化法计算供试品 1 的峰面积为 94. 15%。
本实验除杂过程中,由于熊果酸不溶于水和石油醚,所以分别用水和石油醚去除水溶性和 脂溶性杂质。以 60~90℃的石油醚洗,先浸泡 2 min 再抽滤,滤液弃去,滤渣继续同法洗数次直 至滤液几近无色。通过实验, 1%氢氧化钠水溶液可以洗去一些酸性物质但洗不去熊果酸。用 水洗时,加水沉降 12 h 后抽滤,同样洗至滤液近无色。比较没洗的和洗后的样品的高效液相 图 谱,洗过的样品明显杂质峰已去掉,只有甲醇的溶剂峰和齐墩果酸以及熊果酸的峰。 在重结晶过程中,用活性炭水浴脱色,过滤后放置有白色片状物析出,滤出结晶滤液中仍 有少量淡黄色的固体析出,但晶形不好,且高效液相色谱测定图谱显示后析出的这些固体中齐 墩果酸的含量渐渐增高。所以用热甲醇重结晶时可以分离两种酸但损失产品。另外 ,加入的 活性炭也会吸附产品,造成损失;提取过程中的转移除杂等步骤也会有损失。在本实验中测定 的枇杷叶中熊果酸的含量为 9. 987 mg·g-1,而最后提取得率只约有 40%,约损失了 60%,但由 于绝对含量较高,所以以枇杷叶为原料提取熊果酸是可行的,更好的方法有待进一步研究。 在对熊果酸方法进行了较系统的研究后建立的这套提取工艺是最简单而且最节省时间 和根据理论来讲最切合实际的提取方案。在提取过程中还可以借助超声波辅助提取，随着科 学技术的不断进步， 现代高新提取技术有了快速发展， 超声波辅助提取技术具有省时、 节能 、 对有效成分损害小、提取率高等优点，在现代药物生产中备受关注。相关文章：在迷迭香植物中提取熊果酸对照品的工艺方法
|
