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本文分为上下2篇此篇文章为下篇文章您可以在页尾点击查看上段文章。 二、高效逆流色谱法的研究进展：溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。遗憾的是到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙醋-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等11。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的专著及文献，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统12。
本次实验的目标产物是芦荟苷，为中等级性化合物，这类化合物在乙酸乙酯和氯仿中有一定的溶解性,根据两相溶剂系统选择原则，可以选择以乙酸乙酯或氯仿为有机相主体的溶剂系统,适用溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水或氯仿-甲醇-水。在乙酸乙酯-甲醇-水体系中,随着甲醇比例的增大，芦荟苷类化合物在水中的溶解性增强,因而分配系数变小。在氯仿-甲醇-水体系中,随着甲醇比例的增大,芦荟苷类化合物在有机相中的溶解性增强,由于氯仿的密度比水大,水在上相而氯仿在下相,因而分配系数也是变小。根据贵晓霞13等人在HSCCC分离天然产物中苷类化合物中的最新研究，在苷类化合物的分离中,主要用了三类溶剂体系,即正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水,醋酸乙酯(氯仿)-甲醇(乙醇)-水,醋酸乙酯-正丁醇-水。
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水此类体系主要分离极性较小的单糖苷类,可根据化合物极性差别调整不同比例的甲醇、醋酸乙酯等来调节体系的极性,达到分离目的。常用的溶剂体系有:正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水(6∶3∶2∶5),正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)
醋酸乙酯(氯仿)-甲醇-水此类体系主要分离单糖苷,双糖苷类。由于氯仿毒性大,不利于环保,醋酸乙酯使用的越来越多。可根据需要在上下相中加入不同体积比的甲醇、乙醇、醋酸乙酯等来调节体系的极性,常用的体系有醋酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)。
醋酸乙酯-正丁醇-水该体系用于分离极性较大的双糖苷类。一般通过调整正丁醇比例来分离不同极性物质。若目标组分易溶于该体系上相,加入乙醚可将组分拉向下相,反之,则加入三乙基乙胺盐较合适。常用溶剂体系有醋酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3)
陈存社14等采用几种溶剂系统做对照,从南非进口的开普芦荟凝胶粉末中分离芦荟有效成分,实验表明∶采用氯仿-甲醇-丙酮-水（9∶8∶1∶8）为溶剂系统,分离出芦荟大黄素苷、芦荟大黄素,效果最佳。袁黎明等利用氯仿-甲醇-水（4∶3.8∶2）的溶剂分离系统,亦能对芦荟中的蒽醌类植物成分进行有效的分离,分离后得到12个分离效果较好的色谱峰。而王春燕15等采用氯仿-甲醇-水（9∶10.5∶8）,从芦荟生药中一次性分离得到芦荟甙(纯度99.99%)和芦荟大黄素(纯度95.83%),分别达到定量和鉴别用化学对照品要求。但上一届师姐祁洁珍参考陈存社、袁黎明、王春燕等人的文献进行验证的时候，发现结果均得不到理想的分离效果，原因可能是：一、在配置过程中，发现体系很容易乳化，经过静置等方法也不能消除，造成在分离过程中基线不稳，而且峰形不漂亮，还没掌握消除乳化现象的方法；二、科研过程中有错，缺乏诚信。
祁洁珍师姐用薄层色谱法和高效液相色谱法测定了芦荟有效成分样品在分离用溶剂系统的K值,确定最佳分离体系为（１）：氯仿-甲醇-水（4：3.2：2）和（２）：乙酸乙酯-甲醇-水（5：1.2：5），应用高速逆流色谱法将芦荟样品一次性分离得到蒽醌类有效成分,再用高效液相色谱法检测分离成分的纯度。用溶剂体系（１）进行高速逆流色谱法分离得到两组蒽酯类成分,第一组分含有一未知醌类化合物,第二组成分含有芦荟苷和芦荟大黄素成分,经高效液相色谱法定量分析得,未知物的纯度达90%，芦荟苷和芦荟大黄素的纯度都没有达到预期的效果，用溶剂体系（２）进行高速逆流色谱分离，但是分离结果没有达到预期效果。用（１）溶剂体系可使芦荟中的蒽醌类化合物得到有效的分离，但是所分得的芦荟苷和芦荟大黄素的纯度较低，在以后的实验中，可将分得的两组成分再用另外的溶剂体系二次分离，可望得到高纯度的芦荟苷与芦荟大黄素单体，分别达到定量和鉴别用化学对照品的要求。三、初步实验方案：本实验拟探究用HSCCC分离芦荟苷单体的最佳溶剂系统，在用HSCCC之前将先用其他方法进行分离，比较各种方法的分离效果及优劣势HSCCC方案简略如下：
（一）、确定样品中含有芦荟苷成分TLC定性检测：自行制备硅胶薄板常规点样1~20μL（样品与标准品平行），展开剂为乙酸乙酯：甲醇：水=25：4：3（体积比），若比移值太小，可适当增加大极性溶剂的比例；若比移值太高，可适当降低大极性溶剂的比例.按常规展开，取出薄层板，放平晾干后喷氢氧化钾-甲醇溶液显色（蒽醌苷在碱性条件下的显色反应），对比样品与标准品的Rf值，确定芦荟苷存在与否。HPLC定量检测：(外标法)
精密称（量）取对照品和供试品，分别制成对照品溶液和供试品溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），计算含量。色谱条件可参照色谱柱;流动相:30%-60%甲醇水溶液线性洗脱25min；柱温：室温，检测波长：365nm（254）
（二）、摸索溶剂系统条件
1、先根据一些文献资料进行试实验：1)参考贵晓霞的溶剂系统：醋酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)、王春燕：氯仿-甲醇-水（9∶10.5∶8）、祈洁珍：氯仿-甲醇-水（4：3.2：2）进行条件的探索，以考察分层情况，包括分层时间，上下两相的体积比、有无乳化现象等，并用HPLC测定各系统的分配系数：样品溶于一定体积的溶剂系统中，各取等
体积的上相、下相，风干后溶于等体积的单一溶剂，测定上相的色谱峰面积A1，下相的色谱峰面积A2，Ka=A1/A2。一般K值在0.5～2之间样品可以得到有效的分离。或用TLC法：样品在等体积上下相中分配达到平衡后,TLC展开,通过斑点大小或颜色深浅来判断各组分在两相间的分布状况。
2)选取上述各个溶剂体系，用高速逆流色谱仪分离芦荟甲醇浸膏，色谱条件如下：以溶剂系统的上相为固定相、下相为流动相；以8ml/min的恒流速将上相泵入作为固定相，以2ml/min的恒流速将下相泵入，螺旋管转子转速800r/min，紫外检测波长254nm。记录分离结果并分析3)HSCCC分离条件（溶剂系统）的优化
根据上述实验结果进行调整溶剂体系的选择：溶剂体系是HSCCC分离的关键。好的溶剂体系需满足以下条件：(I)溶剂系统不会造成样品的分解或变性。(ii)溶剂系统不会干扰样品的检测。(iii)各个组分在其两相的分配系数在0.5~2之间，且有一定的差值，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子最好大于或等于1.5;(iv)溶剂系统的分相时间不超过30秒。上下两相体积比合适，以免浪费溶剂;(v)尽量采用沸点低的溶剂，以方便后续处理。(vi)尽量避免使用毒性大的溶剂。然后配制各种不同的两相溶剂体系，看其分相时间是否在30s之内，如果在30s之内分相，加入适量的样品，利用HPLC依次测定各组分在每个溶剂体系中上相和下相的浓度，并计算其分配系数。同时还要考虑是否能有效地分离芦荟的有效成分，直到选出合适的体系。将上述选定的溶剂体系配制、分相、脱气后应用于HSCCC，并对其转速、流速、分离温度、固定相比例和洗脱梯度等条件进行优化，选出最优的HSCCC分离条件。
①螺旋管转速的选择：螺旋管柱的旋转速度对两相的混合程度具有决定性的影响作用，同时它产生的离心力场对固定相的保留也具有决定性的影响。高界面张力的溶剂系统：使用较高的转速，以使两相之间有剧烈的混合而促进分配和减少质点传递的阻力。低界面张力的溶剂系统：使用较低的转速，避免过分的混合作用引起样品区带沿螺旋管长度的展宽和乳化作用带来的固定相流失。②流速的影响：流动相流速也会影响两相的分布，一般情况下，流动相流速越大，固定相流失加重，但流速过慢会导致分离时间过长，从而造成对溶剂的浪费。③温度的影响：温度的提高溶剂的砧度有很大的影响，一般提高温度会获得高的保留值，而相反降低温度则得到低的保留值，但一般温度不可能提高太多，因为所用的都是有机溶剂，沸点很低。
还有一种方法粗制 将风干后的芦荟粉末，加氯仿回流充分提取2小时，振摇，趁热过滤，除去苷元及其他游离蒽醌衍生物，残渣于表面皿风干，以除去剩余的氯仿。将残渣置于索式提取器其中，用95％乙醇水浴回流加热提取4小时，趁热过滤，滤纸用95％乙醇反复洗涤3次，弃去滤渣，向滤液中缓慢加入5％氢氧化钾溶液，玻璃棒搅拌，同时以PH试纸调至9～10，静置30分钟后过滤，沉淀以95％乙醇洗涤3次，合并洗液，置真空干燥箱中，以0.8Mpa，60～70℃，减压浓缩至干，此沉淀即为总蒽醌苷的钾盐。沉淀加入95％乙醇，使沉淀悬浮于乙醇中，缓慢加入冰醋酸，调至PH值中性，水浴加热，趁热抽滤，滤液浓缩，浓缩液加醋酸铅液，均匀振摇，待沉淀不再继续出现，过滤，沉淀以蒸馏水冲洗3次。将沉淀置水中，以HS脱铅，过滤，滤液用1％氢氧化钠调PH值至中性，以iso-proH重结晶，冰浴过滤，所得晶体为粗制芦荟苷。
精制 将所得晶体溶解于70％甲醇中，溶液上Sephadex LH-20凝胶柱层析，以70％甲醇不断冲洗，分段收集。所洗脱依次得到：芦荟大黄素双葡萄糖苷、大黄酚葡萄糖苷、芦荟苷。后段收集淡黄色结晶，减压浓缩至干，即得到精制芦荟苷结晶。上一页：植物中的芦荟苷的提取活性成分的常用方法
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