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		农杆菌菌株以及农杆菌敏感的大豆基因型

　　基因枪转化法也存在一些缺点，另一方面。如外源T-DNA 插入拷贝数较高、结构较为复杂，经常造成外源基因缄默以及目标性状遗传不稳定等问题，因而在一定水平上限制了该方法在转基因研究中的广泛应用。不过，最近有报道表明，减少包裹金粉的DNA 数量可以有效降低T-DNA 插入拷贝数。另外，利用基因枪转化大豆未成熟子叶的周期一般较长(一般大于6个月)也容易造成转化再生植株出现体细胞变异以及后代不育等问题。

　　其独特之处在于能够借助于致瘤Ti质粒编码的Vi蛋白将T-DNA 导入植物细胞并实现在基因组中的整合。自1983年首次利用农杆菌介导法获得转基因烟草植株以来，土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefacien被认为是双子叶植物的天然宿主。目前已获得的200多种转基因植物中，大约85%均来自于农杆菌介导转化法，该方法已成为植物遗传转化的首选方法。农杆菌介导转化的过程主要包括几个步骤：农杆菌积聚、vir基因的诱导表达、T-DNA 复合物的形成、T-DNA 转入并整合到植物基因组。其中，农杆菌积聚、vir基因的活化等过程受植物受伤后产生的酚类物质如乙酰丁香AcetosyringonAS和羧基乙酰丁香酮的诱导。农杆菌的趋化特性以及与植物之间的特异性互作在很大水平上决定了农杆菌适宜转化植物及基因型的范围。尽管外植体损伤可以诱导AS等酚类物质的发生，但是对于大部分大豆基因型来说，损伤诱导发生的酚类物质并缺乏以诱导农杆菌vir基因的活化。通过在共培养基中加入适合浓度的酚类物质如AS可以有效促进农杆菌积聚和附着以及T-DNA 复合物的加工和转移。AS使用也是农杆菌介导大豆遗传转化获得胜利的重要因素之一。由于农杆菌介导转化涉及农杆菌与大豆外植体之间的互作，因而筛选对大豆等豆科植物毒性较强的农杆菌菌株以及对农杆菌敏感的大豆基因型或外植体可以有效提高大豆转化效率。如Yukaea等发现，由野生型农杆菌KA T23改造而来的Soy2菌株转化效率比EHA l05提高了2倍以上；而由野生型农杆菌Chry5改造而来的农杆菌菌株KYRT1转化效率也显著优于EHA 105和LBA 4404另外，通过在共培养基中添加适合浓度的抗氧化剂，降低大豆外植体对农杆菌的防卫反应，减少外植体的褐化反应和坏死，也可以有效提高大豆转化效率。此外，农杆菌转化时，辅助以适当强度的超声波处理，也可以有效提高大豆未幼稚胚和子叶节的转化效率。最近有报道表明，农杆菌侵染阶段进行真空或低盐处置也可以促进大豆转化效率的提高。

　　农杆菌介导转化法具有多方面的优势。一是可选用的外植体类型广泛。迄今为止，与其它大豆转化方法相比。许多研究者对农杆菌介导的各种不同外植体类型如子叶节、未成熟胚、胚尖、胚轴、半种子、初生叶、花序等转化进行了研究，并成功获得了转基因大豆植株。不过由于不同外植体类型对农杆菌敏感性及再生效率不同，其转化效率也存在明显差别。如大豆半种子转化效率(3.8%要显著高于子叶节转化效率(1.5%农杆菌介导转化法的另一个优势是T-DNA 插入拷贝数低，结构简单，外源基因发生缄默的比例较低。Olhoft等对270个T0代大豆独立转化事件中T-DNA 插入结构进行了研究。发现利用农杆菌介导法获得的转基因大豆植株中，T-DNA 插入拷贝数为12个的比例约为79.1%其中单拷贝插入比例为31.5%而拷贝数在3个以上的比例仅为12.5%不过，农杆菌介导转化法也存在易发生嵌合体等方面的问题。就目前已有的报道和作者所在实验室研究的结果(未发表)来看，利用子叶节、半种子、胚尖为外植体获得的转基因大豆植株都有可能发生嵌合体，特别是共培养基中加入抗氧化剂类化合物(如L-cysteinL-cy时，发生嵌合体的比例可能会更高。另外，为了进一步加快大豆功能基因组学的研究，特别是与大豆根发育及与根瘤固氮相关基因的研究，近年来也发展了利用毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogen进行大豆遗传转化的方法。不过由于外源基因主要是不定根中表达，不能够稳定遗传到后代。因此，目前该方法在大豆转基因遗传改良研究中尚没有应用。

　　将包裹在金粉或其它惰性金属资料上的DNA 分子导入植物细胞，基因枪转化法主要是通过物理介导的方法。并实现在植物基因组中的整合。目前基因枪转化法采用的外植体主要是由大豆未幼稚子叶诱导产生的体细胞团，此外也有利用大豆芽分生组织和胚尖作为外植体进行基因枪转化的报道。1988年McCabe等首次利用基因枪法转化大豆芽分生组织，并获得了转基因植株。1991年finer等利用基因枪法转化大豆悬浮体细胞团并获得了转基因植株。1996年Stewart等利用该方法将抗虫基因crylA c导入大豆并获得了抗虫转基因大豆植株。同年，Hadi等利用基因枪法将12个基因同时导入大豆体细胞团，并获得了转基因大豆植株。此基础上，Santarem等，Ponppa等和Khalafalla等进一步研究了影响基因枪转化效率的因素，并对基因枪转化法进行优化。2000年Aragäo等以大豆胚尖为外植体，利用基因枪转化法获得了转基因植株，转化效率达20.1%由于不存在与微生物之间的互作，影响大豆基因枪转化效率的因素可能主要与外植体状态、轰击参数以及转化细胞再生率有关。如Hazel等发现短时间培养(<6个月)大豆悬浮体细胞团转化效率极低，而培养6个月后的转化效率则明显提高。王晓春等发现利用基因枪轰击球形期体细胞团时，其转化效率(8.0%要显著高于发育晚期的体细胞胚(0另外，基因枪转化前将体细胞团置于高渗培养基中培养4h以上(或自然失水处理)后，可以有效提高大豆转化效率。关于高渗处置提高转化效率的具体机制目前还不清楚，一个可能的解释是由于高渗处理降低了体细胞胚的膨压，利于包裹外源DNA 金粉的进入或是减少了金粉对细胞破坏的缘故。

　　基因枪转化技术的一个主要优势是不受大豆基因型限制，与农杆菌介导转化法相比。多数栽培品种均可以通过该方法进行转化，且操作方法较为简单。另外，基因枪转化法可以同时将多个质粒或目的DNA 片段导入植物基因组，且不需要复杂的载体构建过程和选用不同的筛选标志基因。Hadi等利用基因枪法将12个质粒同时导入大豆悬浮体细胞团，获得了携带多个外源基因的转基因大豆植株。此外，基因枪转化法也可以将外源基因直接导入到细胞器基因组中。这一点与农杆菌介导转化明显不同，由于在叶绿体膜上没有T-DNA 复合物可以识别的靶蛋白(如importin类蛋白)T-DNA 不能进入叶绿体中并和叶绿体基因组发生同源重组。Dufourmantel等首次利用基因枪法获得了同质化的叶绿体转基因大豆植株。2005年他又获得了高水平表达抗虫蛋白CrylA b同质化叶绿体转基因大豆植栋。由于叶绿体转基因技术的独特优势(如外源蛋白的高水平表达、环境平安等)基因枪法也为叶绿体转基因大豆新品种培育提供一个新的技术途径。

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