Southern杂交对于高分子量的DNA 如高等生物的细胞核DNA 酶切后很难用电泳分开。单纯用酶切图谱很难说清，往往染出连续一片。另外对于酶切后大小相似的片段其核酸序列是否相似。Southern发明膜上原位DNA 杂交后，使多态性分析更为精确和完善，因此进行RFLP分析研究时，现在都需要进行Southern杂交。典型的方法是DNA 酶切产物用琼脂糖电泳分离后，把胶反过来放在滤纸上，胶的上方放一张同样大小的硝酸纤维素膜，再铺滤纸和吸水纸，并加一重物，胶下的滤纸浸在NaCl柠檬酸钠溶液中，借毛细管原理，溶液不时通过胶进入上面的吸水纸层，DNA 随溶液从原位转到硝酸纤维素膜上，这就是毛细管转移法。另外还可通过电转移或真空转移法将DNA 片段转移至纤维素膜上。转移好的硝酸纤维素膜经80℃烘烤2小时，将DNA 片段固定于膜上，用放射性同位素标志的探针与膜一起保温，复性条件下，凡与探针同源的膜上固定的DNA 就能结合上探针，洗去没有结合的探针，放射自显影就显示出与探针同源的DNA 片段。简单地讲其过程包括 ⑴ DNA 纯化和酶切；⑵ 酶切片段 电泳分离和转移；⑶ 标志杂交探针；⑷ 膜上DNA 杂交；⑸ 同源片段的显示。
现在许多实验室在转移时使用尼龙膜。不易碎，据称这种膜机械性能好。可以反复使用，即用一个探针杂交显示RFLP后，可以洗去探针，用另一个探针和膜上的DNA 再杂交，如此重复3-5次，得到数个RFLP另外尼龙膜上的DNA 固定可以用120℃半小时或紫外线照射几分钟，节省了时间，还可以在碱性条件下直接转移DNA
导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）DNA 水平的差异（即多态性）多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA 克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark构建分子图谱。限制性片段长度多态性（RFLVIP(pr)estrictFragmentLengthPolymorphRFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。第一代DNA 分子标志技术。DoniKel利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLVIP(pr)estrictFragmentLengthPolymorphism,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失。限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变。
即表示目标基因与分子标志之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标志克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA 后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标志组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,标明这个性状（基因）与分子标志连锁。分子标志与性状之间交换值的大小。当某个性状（基因）与某个（些）分子标志协同分离时。EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标志则有几个甚至上千个。分子标志越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。
RFLP分析是集限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针杂交等技术于一体的综合应用。其原理如下：每一限制性核酸内切酶在切割DNA 分子时都有固定的切点序列，多用于临床遗传性疾病的基因诊断。DNA 分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该切点丢失或增加。由于不同生物群体的DNA 序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA 片段的长度分布也是千变万化的这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(RestrictFragmentLengthPolymorphRFLP其常用于生物群体的遗传分析。
然后在琼脂糖凝胶上电泳分离后对所得图谱进行分析比较得出分类结论，以显示不同种群基因组DNA 限制性片段长度多态性。RFLP发生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定。RFLP可以对大量的DNA 样品进行有效的分析，同时，对mtDNA 线粒体DNA 分折对种内或种问的分类会更灵敏。此外，核糖体rRNA 分析也已应用于真菌种间和种下的亲缘关系。限制性片段长度多态性(restrictiongfragmentlengthpolymorphism,最初用于有性繁殖后代的分离以构建遗传图(Botsteiet1980也是第一代以DNA 指纹图谱为基础用于环境微生物分型鉴定的方法。其原理是利用适当的限制性内切酶在特定位点上将细胞基因组DNA 切割成不同长度的片段。RFLP分析。
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