RFLP探针来源于构建的DNA 质粒文库，对于探针的来源。但也有人用PCR方法直接扩增DNA 特定序列作为探针。探针的标志主要有两大类，一是用同位素标志，如32P和35S等，早期的RFLP分析就是采用同位素标志探针检测多态性，但这种标志存在一些缺点如半衰期短，标志的DNA 不宜保管以及环境污染等问题。另一类是非同位素标志法，这类方法是许多实验室经常采用的方法，如生物素标记法，最简便的用PCR反应直接将生物素化－11dUTP作为局部底物合成DNA 链，这种产物便可作为核酸探针。另外还有地高辛(Digoxigenin标志法，辣根过氧化物酶标记法等。
主要是利用腺病毒连锁的温度敏感性突变对特定的限制性片段长度的差异把这一突变定位到限制性片段的物理图谱上。Zuerner等在研究肾脏钩端螺旋体分型时，RFLP最早于1974年作为一种工具用于遗传研究。采用RFLP技术几乎可将肾脏钩体型内各血清亚型区分进去，即在限制性内切酶切分析的基础上再进行Southern杂交，但单独使用限制性内切酶分析则不能全部区分出各血清亚型，四株酶切图谱相似的血清株中，用Southern杂交则能逐一加以区别。Torpstra等和Thiermann等也同时指出单独使用限制性内切酶分析也难以区分具有类似酶切图谱的钩体血清亚型。因此辅以核酸杂交的RFLP分析对肾脏钩端螺旋体的流行病学研究及分型鉴别具有重要的实用意义。
除了RELP分析外，扩增片段长度多态性分析 目前。还开发了DNA 扩增片段长度多态性分析，使DNA 片段多态性分析技术更为快速和完善。
人们就从已知是多态性的DNA 序列动身，扩增片段长度多态性(AmplificFragmentLengthPolymorphAFLP聚合酶链反应(PCR基础上进行的一种核酸分析方法。PCR发明不久。设计一对引物进行扩增，然后用琼脂糖电泳和溴化乙锭染色检查扩增产物在数目和分子量大小上的变化，这种方法与RFLP不同的以扩增代替了酶切，其优点是防止了RFLP烦琐的DNA 酶切、转移和杂交等步骤，而且只需要很少量的模板DNA 缺点是必需事先了解位点的序列，这种AFLP又称为专一扩增多态性(SpecifAmplifiPolymorphSA P如Jefferei等(1988根据人小卫星DNA 序列，设计引物进行人 DNA 基因扩增，得到高多态性的小卫星扩增图谱，大大减少了模板DNA 需要量。
即将DNA 特定序列用PCR方法扩增，聚合酶链反应/限制性片段长度多态性分析法(PCR/RFLP目前有些研究者将PCR和RFLP结合起来对DNA 进行研究。其扩增产物再用限制性内切酶进行酶切分析。朱沛轩等采用PCR/RFLP方法对100株B群脑炎奈瑟氏菌进行分型研究，根据这类细菌的1类外膜蛋白基因(PorA 设计引物并扩增，受试菌株均扩增出 116bP片段，以限制性酶MspI消化发生6-8条酶切片段，通过对这些片段的长度和数量的分析，结果将受试的100株细菌分为33种RFLP型(B1-B33其中B20型内的菌株数量最多 占31％)且多有致病性(29/31与非致病性的B21B22酶切图谱中只有个别小片段位置差别，反映出基因突变后一个切点移位导致酶切图谱的微小变化。这种方法分辨率高、重复性好、简单快速。张晓峰等使用PCR/RFLP方法对康氏立克茨氏体的基因型进行了分析，根据立克茨氏体190KD蛋白基因序列设计一对引物并用于扩增来自南非、埃塞俄比亚、摩洛哥、印度及俄罗斯等地的七株立克茨氏体、扩增结果出现三种不同分子量大小的片段，标明这三类菌株的扩增基因中核苷酸排列相互不同；扩增产物用限制性酶Rsal及Pstl酶切则可得到四种不同的RFLP图谱，进一步标明康氏立克茨氏体各株间基因型存在着差异。
从而进行多态性分析。与特异性引物扩增有几个不同点：⑴ 特异性引物根据多态位点DNA 序列设计，3.随机扩增多态DNA RA PD随机扩增多态DNA RandomAmplifiPolymorphDNA 用单个或单个以上的随机引物扩增DNA 发生长度不等的片段。一般成对使用各长20bP左右的引物，RA PD引物则完全随机，长度不等，多为8-10bp一般为单个使用，G＋C含量一般在50％以上；⑵ 特异性引物扩增退火温度较高，碱基配对要求严格，RA PD退火温度较低多为 35-36℃，允许适当的碱基错配，从而引发更多的扩增子(Amplicon增加监测多态性的能力。RA PD引物的序列完全随机，几乎可以用于任何生物而揭示其整个基因组的多态性，因此得到广泛应用。孔繁荣等在淋球菌菌种鉴定及分型研究中采用RA PD技术用随机引物对淋球苗WⅠ、WⅡ、WⅢ三群的基因组DNA 进行扩增、三群细菌均表示出共有的特征性条带以及各群特有的条带，标明三群淋球菌的基因组同源性很高，表示型”上的共性占主导地位，另一方面也说明了三群细菌在基因组DNA 中存在一定差别，因此根据这种多态性可对细菌进行分类和鉴定。Feket等采用5个不同的随机引物单独或成双使用对25株不同的布氐杆菌进行随机引物扩增性片段长度多态性研究。对未知DNA 序列的布氏杆菌采用随机引物扩增，结果显示在同等扩增条件下，不同的布氏杆菌表示出不同的基因类型，因此根据扩增产生的片段长度多态性可检测诊断特异性菌株，解布氏杆菌间的基因关系，计算相似系数等。
|
