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| 气相色谱分析确证转基因植株具有合成PHB能力 | |||
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自然界中多种细菌的碳源及能源贮藏物这种聚酯的物理化学特性与激进塑料相似，聚三羟基丁酸酯（PHB;种子特异性启动子;叶绿体基因工程;烟草;油菜及其它类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质。并具有生物可降解性，如能取代化学合成塑料将减少环境中的塑料废弃物，从源头治理“红色污染”问题。微生物发酵法生产的PHB价格过高，无法在市场上与化学合成塑料竞争。随着分子生物学的发展，人们逐渐将视线转向植物生物反应器。转基因植物能够利用二氧化碳为碳源、太阳能为能源合成目的产物，大大降低生产本钱，为生产具有市场竞争力的新型生物可降解塑料提供可行途径。此领域虽然已取得一定进展，但远未达到商业化生产水平。大规模商业化生产要求转基因植物能够在确保环境平安性的前提下高效、稳定地生产PHB本文尝试改善植物中PHB生产体系，为环保型塑料早日进入市场作出努力。由于表达框架中多次使用同一启动子会导致基因缄默，本文克隆了另一种子特异性启动子nap300以替换重复使用的7S启动子，减轻“共抑制”将nap300与GUS基因相连进行功能鉴定。
荧光检测和组织化学染色的结果都证明此仅300bpDNA 序列足以调控基因进行种子特异性表达。尽管B盒作为高度激进区在种子特异性表达中起重要作用，位于此处的两个碱基替代型突变并未使nap300活性明显降低，对启动子的时空表达模式也无明显影响。将nap3007S分别与phbA 基因(编码 3-酮硫裂解酶)相连，相似表达环境中对二者功能进行比拟，发现两个启动子表达模式基本相同并在同一时期达到活性高峰，因此nap300可用于改善PHB合成基因在植物体内的表达调控。通过对种子特异性启动子的比较可加深对其表达模式的解，为植物基因工程中的精细调控提供依据。叶绿体基因工程是随着植物遗传转化技术发展刚刚兴起的生物技术，具有超量表达外源基因，为原核基因提供适宜表达环境，消除“位置效应”和基因沉默，环境平安性好等优点，较更适合用于植物生物反应器方面的研究。本研究在国内率先探讨将叶绿体转化技术引入植物生产生物可降解塑料这一领域的可行性(国外仅有日本一例)构建了叶绿体转化及表达载体pPV-PHB通过基因枪法将PHB合成相关基因导入烟草叶绿体基因组。转基因烟草顺利达到同质化，其形态和生长发育均无异常。Northern点杂交检测标明与PHB合成相关的三个基因均能在转录水平表达，未出现核转化中经常发生的基因缄默”现象。通过RT-PCR进一步检测标明叶绿体型转基因烟草中目的基因的表达水平明显比核转化植株中相应基因的表达水平高。气相色谱分析确证转基因植株具有合成PHB能力。
这些都标明叶绿体转化适合用于转基因植物生产PHB中 文 摘 要的研究。虽然叶绿体型转基因烟草中产物含量偏低，并未达到预期结果，但经进一步改进与完善，终将会胜利地用于生产高附加值产品的植物基因工程中。为初步探讨叶绿体转化中在同源重组反应介导下整合外源基因的机理，从油菜叶绿体基因组中分离两段序列作为同源片段，基因枪法转化烟草，结果显示即使供体所含同源片段与受体叶绿体基因组相应区域差异高达 10％，转化效率也无降低。这一现象的发现有助于促进“通用载体”改进，扩展叶绿体转化受体范围乃至达到商业化应用水平。胜利地通过H次转化获得整合并表达多基因的转基因烟草，缩短了研究周期，对相关转基因植物的研究有一定参考价值。本文还优化了油菜转化体系，使转基因油菜同时整合三个 PHB合成相关基因的效率由 7．69O增加至 16．00田间试验与产物分析正在进行中。
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