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| 质谱法荧光胺法两种方法进行准确测定的前提条 | |||
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质谱法由于PEG的分子量较大，多采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定修饰前后生长激素的质量数，将质量数之差除以PEG的分子量，即可得到每一分子rhGH上，发生修饰的PEG数目。但是，由于MALDI-TOF脉冲式的离子化方式不能精确定量，对于发生多点修饰的rhGH，只能用该方法计算PEG的结合数目，而无法准确计算平均修饰率。因此，该方法只适用于计算单位点修饰药物的平均修饰率。目前我国企业生产的3种PEG-rhGH，均为单位点修饰，利用MALDI-TOF测定的平均修饰率应为10%左右。
荧光胺法Stocka等人首先采用荧光胺法测定PEG修饰蛋白的平均修饰率[6]。该方法的灵敏度较高，仅需纳克级的蛋白质就能完成。荧光胺本身不发荧光，但可在碱性环境中共价结合到游离氨基上，生成具有高荧光强度的荧光衍生物。没有参与反应的荧光胺则迅速水解为不发荧光的物质。因此，与TNBS法相比，荧光胺法具有更高的灵敏度。与TNBS法相似，荧光胺法同样受反应温度、pH值、时间因素、游离氨基、还原物质的影响，所以应针对不同的PEG化蛋白进行反应条件考察，并建立相应的rhGH工作对照品。同时，由于荧光胺在水溶液中分解极快，为保证操作的便捷与准确性，应将荧光胺的丙酮溶液直接加入到反应液中，并迅速混匀，而不宜在接触到蛋白质溶液之前用水溶液稀释荧光胺。
TNBS法1966年，Habeeb等人采用三硝基苯磺酸（TNBS）与蛋白表面赖氨酸的ε-氨基和α氨基发生反应，生成在375nm处有特征吸收的三硝基苯酚（TNP）。对于采用游离氨基作为蛋白连接位点的PEG修饰蛋白，PEG修饰将直接减少蛋白表面的自由氨基，因此可以通过将吸光度值与蛋白浓度作图，求得PEG-rhGH与rhGH的斜率，将两者的斜率之差除以rhGH的斜率即可间接计算PEG的修饰程度。但是，该方法的影响因素较多，要求修饰前后的供试品中不得含有游离氨基，不得含有还原型物质，不得含有SDS等表面活性剂，并且极易受到环境温度、pH以及游离PEG的影响。同时，该方法中络合物随着反应时间的延长，吸光度值不断下降，需要考察适宜的反应中止方法以保证测定准确性。而rhGH国家对照品中因为添加了甘氨酸等赋形剂，不能直接用于TNBS法的检测。企业需考察 rhGH与PEG-rhGH在不含上述辅料剂型中的稳定性，并提供rhGH的工作对照品。
PEG的平均修饰率目前，PEG修饰蛋白的质量标准中平均修饰率的检测方法主要有：三硝基苯磺酸（TNBS）法、荧光胺法、质谱法、液相-示差/蒸发光检测器联用法等。其中，前两种为间接测定法，要求对修饰前后的蛋白质准确定量。该类方法属普通的化学与荧光发光法，操作相对简单；后两种属于直接测定法，虽然结果较为准确，但所用仪器较为特殊或昂贵。因此，建立质量标准时，应考虑采用直接法获得较为可靠的平均修饰率数值，随后建立三硝基苯磺酸（TNBS）法或荧光胺法而纳入标准。同时，如能成功建立直接法中的“液相-示差/蒸发光检测器联用法”，不仅可以准确控制单位点或多位点修饰的PEG-rhGH的平均修饰率，还可以同时进行游离PEG测定，以及PEG的定性鉴别。
上述两种方法进行准确测定的前提条件是，无论修饰前后，rhGH都必须处于充分舒展的状态，所有的结合位点都能充分暴露。但是，由于PEG枝杈型的空间位阻效应，同时方法易受常规变性剂的干扰，测定结果不可盲目追求理论平均修饰率10%，应根据多批次测定结果，合理制定限度范围。
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