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| 液相-示差/蒸发光检测器联用法 | |||
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液相-示差/蒸发光检测器联用法PEG分子在280nm下并无特征紫外吸收，而活化后的PEG分子，由于活性基团的引入，可能存在214nm下的紫外吸收。因此，为了检出以各种形式存在的PEG，应采用通用型检测器，并结合凝胶或反相等高效液相色谱对修饰前后的rhGH及游离的PEG进行分离。由于示差检测器的灵敏度较低，同时只能使用恒梯度流动相，因此，不适于检出痕量的游离PEG。而蒸发光检测器在上述方面有较大优势。首先通过优化色谱条件，将PEG-rhGH、rhGH与游离PEG有效分离后，再将PEG从修饰后的rhGH上水解下来；通过计算水解后PEG减去游离PEG的量，再除以PEG的分子量得到偶联到rhGH上的PEG的摩尔数，进而通过紫外检测器求得rhGH的摩尔数，两者之比再除以10（每分子rhGH的理论修饰位点），即可求得较为准确的平均修饰率。该方法不仅可适用于单位点或多位点PEG-rhGH的平均修饰率测定，而且可有效鉴别不同生产厂家使用的不同种类的PEG，同时可测定原液中的游离PEG含量，实现一个方法进行三项重要指标的质量控制。但是，目前该类方法可供参考的国内外文献极少，方法的建立需要投入较大的工作量。
PEG的修饰位点rhGH上可发生PEG修饰的位点有10个，即使均为单位点修饰，理论上也可能存在10种位点异构体。同时，PEG分子本身是由一系列具有一定分子量分布的物质组成的混合物，因此，每一种位点异构体也就成为了较复杂的混合物。这就给PEG修饰位点的测定带来了巨大的难度。目前可采用2种方法进行PEG修饰位点的测定：液相肽图法与离子交换分离位点异构体法。这两种方法都需要结合质谱，对rhGH液相肽图中的色谱峰准确定性。在此基础上，前者推断修饰位点，后者可较为准确地测得修饰位点。
液相肽图法首先需建立适宜的rhGH与PEG-rhGH的酶切方法。由于PEG是具有枝杈结构的大分子物质，与蛋白质分子共价结合后，由于其空间位阻的屏蔽作用，使得蛋白酶很难作用于PEG-rhGH，这也是PEG-rhGH在体内具有较长半衰期的原因。因此，对于PEG-rhGH，不能照搬rhGH药典酶切方法，应深入研究个酶切参数，使得蛋白酶既能完全水解rhGH与PEG-rhGH，得到尽可能多的理论肽段，又能避免非特异性酶切片段的产生。
随后应建立适宜的反相液相肽图分离方法。一个经过优化的RP-HPLC液相肽图，是控制PEG-rhGH修饰位点最直观和便利的方法。因此，不可照搬rhGH药典液相肽图法，需反复优化色谱分离条件，使得通过比较修饰前后的肽图，既可推断PEG的修饰位点，又可将不同种类的PEG-rhGH与rhGH区分开。
二硫键未被还原的rhGH经胰蛋白酶酶切后，应产生19个理论肽段，除去3个极性很强无法保留的肽段T3、T5、T18以及1个仅含有1个lys的T17，应在RP-HPLC肽图上出现至少15个肽段。同时通过还原酶切液，可推断两个二硫键肽段T20-SS-T21与T6-SS-T16的色谱峰位置。由于T20-SS-T21本身不含有PEG的修饰位点，T19肽段也不含有PEG修饰位点，因此在PEG修饰前后rhGH的酶切液中，该肽段不会发生峰位置和峰面积的变化。那么在酶切完全的前提下，rhGH酶切液中各个肽段的峰面积与T20-SS-T21或T20的峰面积之比（k值），应为一个相对固定的数值。而在PEG-rhGH的酶切液中，连有PEG的肽段，其保留时间将发生改变。虽然由于位点异构体的存在，该位点仍有未被PEG化的肽段出现，但是这一位置肽段的k值与未修饰rhGH的k值比较，应有所下降，且降低的程度反应了被修饰肽段的相对含量。因此，通过大量实验，可累积获得rhGH与PEG-rhGH各肽段的平均k值，根据两者的k值变化，可以推断哪些位点发生了主要的修饰及修饰肽段的大致含量。
由于有些PEG的位点异构体所占比例可能较低，难以通过k值变化进行测定，应尽可能对主要修饰肽段进行控制。方法成功建立后，除了可用于原液的鉴别检查外，还可在质量标准中规定发生主要修饰的肽段，其峰面积百分比不得超过的限值。由该方法确立的主要修饰位点及所占比例，可通过两种以上蛋白酶酶切及阳离子交换色谱与等电聚焦电泳进行深入的验证分析。本文由对照品网整理提供如涉及文章版权问题请联系作者删除，文章转载请注明地址：www.gjbzwz.com
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