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| 实验装置化学发光测定法实现的测量 | |||
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实验装置对PS-阿托工作试剂的制备以1:1的比例相结合，两种解决方案。一系列10倍稀释的辣根过氧化物酶的Biozyme实验室国际有限公司（圣地亚哥）用水稀释。发光从PS-阿托与HRP反应的时间过程，评估重复的100微升等分试样的工作试剂反应3.5?10-16摩尔的HRP在25℃下 光照强度记录在任何一个设计公司（桑尼维尔，CA）特纳 TD 20E光度计提供一个中性密度滤光片，光强度或热Labsystems（富兰克林，MA）Luminoskan微孔板发光衰减。除非特别注明，所有的化学发光测量是在室温下进行。
化学发光峰强度的关系的HRP量测定反应，一式三份PS-阿托和TMA-6分别与HRP溶液中制备的取值范围为1.4的10μl的工作溶液的100微升等分试样10-16日圆1.4?10-21摩尔。随后光发电混合时，迅速达到最大强度。光强度的记录，6分钟混合后，在任何一个TD 20e的萤光光度计或Luminoskan 96 - 孔板的发光计。（本文中给出的强度测量，数字和表格是在相对光单位RLU）。
PS-阿托TMA-6存储稳定性超过1年的时间内进行评估。工作溶液和单独构成的解决方案的样品贮存于4℃，室温和40℃下在棕色不透明的聚乙烯瓶中。等分被撤销的时间间隔和分析的背景发光和发光峰值3.5?10-16摩尔HRP在25°C。百分比剩余活性测定比较，与对照样品贮存于4℃。后者独立没有表现出改变的信号强度超过一年的存储分离的组件解决方案。
表一HRP量使用PS-阿托化学发光检测或TMA-6（点击放大）发光强度的关系。甲测试抗原??，β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶标记抗体的Western blot分析进行使用硝酸纤维素膜和化学发光检测TMA-6，5000的范围内，在与β-半乳糖苷酶的标准5皮克。短暂孵育印迹与试剂，排出过量的试剂，并在2小时的过程，潮湿的印迹与X射线胶片成像。
结果对PS-阿托检测试剂由PS-阿托底物化合物（参见图3a）中的缓冲溶液中含有酚性增强剂，过氧化氢，和其他专有组件以获得最佳的分析性能。TMA-6类似的配方中含有过氧化物酶的底物化合物（参见图3b）。
图6。TSH酶联免疫吸附试验使用的的科瓦斯核心免疫检测试剂盒（罗氏）的组成部分。发光检测采用PS-阿托。二次抗体结合物稀释2倍，以提高信号相对于背景。比色法数据来自包镶（点击放大）。
对PS-阿托基板与辣根过氧化物酶和过氧化氢的氧化作用被认为是产生二氧环乙烷中间体，随后片段，以产生处于激发态的吖啶酮（参见图4）。反应所发射的光的跨越约400-550纳米的区域中，与极大值，在430和445 nm。的频谱匹配的荧光光谱N-benzylacridone的。TMA-6与HRP的氧化涉及到一个类似的机制，发射极为N-phenylacridone的。最大化学发光的PS-阿托几乎是相同的。
PS-阿托或TMA-6试剂与HRP的反应混合后立即产生化学发光发射。最大强度达到几秒钟后，在室温下和在反应过程中保持恒定强度的几分钟（参见图5）。高原反应的HRP与PS-阿托化学发光强度呈线性关系的酶的量超过至少4个数量级，如示于表Ⅰ的曲线的斜率是由方程描述 Y = 0.931x + 18.689，R2 = 0.999。类似的动态范围的HRP定量测定时的反应均在25℃和37℃下，使用PS-阿托。（数据未示出）测量的动态范围TMA-6，并没有延伸到尽可能低的水平，使用的条件下，与PS-阿托。
活性的PS-阿托工作后各个时期的存储保持的解决方案，在4℃下或房间的温度（a）中所占的百分比TMA-6工作溶液的活性的能力，后各个时期的存储保持在4的容量百分比°C（B）。活动表示新鲜制备的组件单独保存在4℃（点击放大）对照样品。极端的检测灵敏度允许的发展高度敏感的酶免疫测定。与PS-阿托化学发光检测ELISA试剂盒的cobas核心商业促甲状腺激素（TSH）由罗氏（巴塞尔，瑞士），它采用比色法检测抗体-HRP偶联物，被修改。比色法报价0.05 MIU / L，检测限为提供的最低标准是1 MIU / L。共轭双重稀释和PS-阿托代检测试剂，化学发光检测法适合。标准稀释至0.003 MIU / L。
此化学发光测定法实现的测量，0.003庙/ L（见图6）。的信号的最低的校准器，20.5±2.3 RLU，大大超过了空白10.2±2.3 RLU，所以计算出的检出限的检测实际上是有点低。此值不表示为了充分优化的检测，然而，测量化学发光绑定手动试管格式的在聚合物珠粒的表面的试剂时，分析的灵敏度受到不利的影响。
为了评估的试剂的稳定性PS-阿托和TMA-6的工作解决方案，这些解决方案相结合，这两个组件的50微升等分试样和存储的混合物在4℃下，并在室温制备。3.5?10-16摩尔HRP化学发光检测运行在25°C 这些测量是比获得的值分别存储在4℃下用新鲜制备的试剂从组件 结果显示：在贮存试剂的性能没有劣化，在室温下?3周。PS-阿托不变，4个月后，在4℃，TMA-6和9个月后在该温度下保持不变（参见图7）。
在另外的实验中，含有过氧化物酶底物的溶液成分在室温下孵育，并在40℃下了数个月。结合的第二成分和上述测定得到的工作溶液的等分试样。与使用新鲜配制的溶液，从组件分开存放在4℃下所获得的结果进行了比较 没有可检测到的信号的变化，观察到在工作解决方案，无论是从衬底制备试剂分开存储长达5个月，在40℃下，在室温下或1年。
与过氧化物酶结合的抗体和化学发光检测TMA-6蛋白抗原的Western blot法检测的β-半乳糖苷酶的抗原检测系统进行。抗原涂抹量为5皮克5纳克。物Lumigen PS-3和最敏感的商业鲁米诺试剂ECL +硝酸纤维素膜（Amersham Biosciences公司，英国Amersham）进行了比较。TMA-6的检测限低至或低于目前使用的最敏感的试剂。背景发光控制良好，足以让低皮克数量的抗原检测。所有的抗原的水平检测到在从10分钟至2小时的时间点（参见图8）。
图8。西方涂抹图片TMA-6采用5秒曝光用化学发光法检测β-半乳糖苷酶。印迹证明皮克灵敏度超过2小时的时间内，A = 5000，B = 1000 PG，PG C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5皮克。描绘的时间点是：（一）第11分钟，及（b）120分钟（点击放大）。
TMA-6工作解决方案的长期稳定提供了进一步的措施，进行了超过1年期间通过串行Western印迹检测。印迹协议的性能比较上述被描绘（见图9），使用新鲜与1岁的TMA-6工作解决方案。结果表明减值印迹检测灵敏度。
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