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| 过氧化物酶和过氧化物酶结合物化学发光检测 | |||
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物Lumigen PS-阿托TMA-6是新的过氧化物酶和过氧化物酶结合物化学发光检测试剂。每个这些试剂的试剂溶液制备按将两种水溶液以1:1的比例相结合，并包含专有的基板，过氧化氢 ??，和增强子在缓冲溶液。的过氧化物酶与试剂的反应非常迅速产生的峰值光强度。与目前使用的基于鲁米诺试剂，这些积累基本上没有涉及排放峰值时间。
高原强度的发展，在实验中，光测量的精确定时是不必要的，用于确定光强度对酶量的依赖性。光的强度是足够的，使检测10-20摩尔的HRP在6分钟的测定与PS-阿托和10-19摩尔TMA-6的两倍以上使用极限的检测标准的信号的空白空白的标准偏差（见表I）。日志日志积光强度与HRP在实验范围内10-16-10-20摩尔摩尔展出了高线性度。据预计，分析精度和动态范围将得到改善，从更大数量的复制具有更宽的动态范围的测量仪器上的数据加以收集。
图9所示。图像比较西方涂抹新鲜制备β-半乳糖苷酶检测化学发光TMA-6工作解决方案（一）及（b）于4℃保存1年 他们两个有9分钟的孵育膜在TMA-6和5秒的曝光后得到。（A = 5000，B = 1000 PG PG，C = 180皮克，D = 30 PG，和E = 5 PG） （点击放大）。
虽然与TMA-6溶液中测定的过氧化物酶的检测提供了几乎相当于实现了与PS-阿托的灵敏度和工作范围，更高的绝对光强度与PS-阿托对于一个给定的酶量有所放大的非特异性结合的影响印迹膜。这可以有效果，在某些情况下限制印迹检测的灵敏度。此外，TMA-6所产生的光的强度较低，允许使用较高的底物浓度在工作试剂。这反过来，最大限度地减少扩展孵化或暴露在高层次的结合酶底物耗尽。
膜基印迹检测的检测试剂可靠的比较是非常困难的。如在下面更详细讨论的，印迹膜，特别是由X射线胶片上的光密度，定量测量是不精确的。推断的检测试剂的影响独自从这种类型的测量需要谨慎。另一个困难是抗体数量和灵敏度明显的阻塞条件的影响。这些参数必须在印迹法凭经验优化。哪些参数是最优的出现依赖于检测试剂的选择，以及蛋白质分析物和其他因素。任何打算检测试剂进行比较，然后，面对所有分析变量标准化，在这种情况下，一些测试将在非最佳条件下进行，否则使用单独优化的条件下进行技术上的不平等比较与选择。
铭记这些注意事项，TMA-6，成立于ECL提前Amersham Biosciences公司Western印迹检测试剂盒，已经比7两个基于鲁米诺试剂和试剂含有9,10 -二氢吖啶PS-3 Western blot检测系统的性能。TMA-6检测试剂所示，可提供优越的背景信号，并检测蛋白水平的降低比其他材料。每个试剂单独优化的实验条件下使用。
过氧化物酶和结合物的高灵敏度地检测的化学发光试剂的市售了好几年。在使用中的大多数试剂构成增强鲁米诺的检测系统。例子包括Amersham公司的ECL，从皮尔斯生物技术公司（Rockford，伊利诺州）超级信号，Lumiglo从嘉里建设有限公司（马里兰州盖瑟斯堡），以及罗氏和邻临床诊断试剂。物Lumigen PS-1，唯一先前nonluminol的过氧化物酶检测试剂使用的9,10 -二氢吖啶酯化合物作为过氧化物酶底物。所有这些试剂都由其制造商提供的，作为两个独立的部件，必须在即将使用前进行组合，以创造一个有效的解决方案。这两个工作溶液中过早反应的底物与过氧化氢 ??的混合试剂中的底物的水解不稳定性的问题，防止长期贮存溶液。
一些商业化学发光过氧化物酶底物的工作方案规定的有用寿命进行了调查。他们发现范围从“几个小时”24小时在室温下。更稳定的工作试剂解决方案提供了简化的自动化分析的优势。
对PS-阿托和TMA-6基板的设计的早期发现，的化学发光AP衬底物Lumigen APS-5也经历了化学发光的过氧化物酶与过氧化氢 ??的催化反应（参见图10）。反应的APS-5与提示这两种酶产生强烈的化学发光。环外双键化合物与更大的水解稳定性一个硫基结果，在更换的磷酸基团。
在这种结构类超过50种不同的候选化合物已准备和测试。选择两种化合物用于商业开发解决方案的分析和固相分析TMA-6，PS-阿托，在结构上非常相似，但有微妙的不同性能。令人满意的水溶性的烷基磺酸取代基，每个分子中内置凭借保留。朝向过氧化物酶的酶促活性被保留，为的是达到最大光强度的速度，。得显着，未观察到过氧化氢在衬底中的乙烯基硫醚基团的非酶自氧化，即使在最后的工作溶液。
PS-阿托和TMA-6，评估通过监视它们的任何变化后的存储期间的化学发光峰值强度，工作溶液的试剂的稳定性明显优于其它试剂在使用。只要为3个??星期，两个试剂的工作溶液，在室温下稳定。解决方案可以在4℃下储存，??并使用几个月，如在图7中示出。结果控制通过比较新鲜配制的工作液。含过氧化物酶底物的组分溶液表现出甚至更长的贮存稳定性。没有可检测到5个月后，在40℃或1年??，在室温下在溶液中测定的性能退化的发生。这种程度的水解稳定性远远超过所有其他商业的化学发光过氧化物基板。
用于可视化固定化的酶标记抗体的化学发光检测试剂不一定必须符合相同的严格标准的贮存稳定性，例如，试剂在船上使用一个自动免疫分析仪必须。由于精度分析很少印迹技术正式评估，测量往往是最好看作是半定量。按键实验变量是很难控制的抗体的质量，膜性能，阻塞协议和绑定协议。此外，X射线胶片图??像的光密度分析不能检测在二维光强度图案的细微的差别。（现代CCD相机成像系统，但是，改进的能力有些印迹分析。）
由于这些原因的检测试剂的质量随着时间的推移，微小的变化不会导致可测量的衰减印迹检测性能。TMA-6存储的质量的评估工作溶液中的官能印迹测定形式，在结果没有差异，得到即使在溶液中，使用可以在更严格的，仪器为基础的解决方案测定中看出一些性能劣化。TMA-6存储长达一年的工作方案，在4°C，使用前涂抹检测的蛋白质，从而是可以接受的做法。
结论PS-阿托是第一化学发光的过氧化物酶底物，提供了能够被存储为一个瓶使用的试剂。在4℃下稳定性的测试没有发现存储的工作溶液，在室温下或4个月?3周的试剂的性能恶化 此外，过氧化物酶底物本身是稳定的，在室温下了数个月。工作溶液的扩展的贮存稳定性允许一个单一的容器内的试剂，可以采用过氧化物酶的化学发光检测。除了这种方便的明显的好处，PS-阿托可以使用，而不需要额外的泵送和混合装置将自动分析仪器。它能够允许的极端敏感性过氧化物酶检测定量过氧化物浓度超过四个日志，检出限10 zmol在6分钟检测在保守估计。
TMA-6，印迹应用中使用，如Western印迹法，开??发股份PS-阿托在快速信号的产生和试剂的稳定性方面的优点。它允许基于膜的印迹检测的高灵敏度检测。成像参数的优化，以提供足够的时间，信号的持续时间被延长的典型的印迹膜。
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哈希姆，博士，AKHAVAN Tafti的是副总裁兼首席科学官，谢文化，哲学博士，和雷努卡DeSilva酒店，博士，研究的科学家威廉·G·克里普斯和罗伯特A. Eickholt是研究化学家理查德·汉德利博士，主任知识产权朗达·林斯基和迈克尔·Mazelis是研究化学家A.保罗Schaap博士，物Lumigen公司（密西根州Southfield）的总裁。
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