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| 仪器子系统的设计选择会影响检测 | |||
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基因芯片技术研究做出了巨大贡献，在许多领域，包括增长，老龄化，发病和进展，对药物的反应，在植物和动物的愈合。世界各地的研究人员继续完善这项技术，把目光投向芯片的工具，为临床诊断使用获得监管部门的批准。什么是特别重要的是，微阵列成像系统应该具有最高性能标准的芯片产生的大量数据，为方便解释。
任何荧光微阵列成像系统的基本要求是在样品上，以激发荧光染料，收集发射的光，并生成数字图像的荧光信号。两种通用方法可用于获得这样的图像：激光激发，用光电倍增管（PMT）检测器，并过滤白色光激发用的电荷耦合器件（CCD）检测器1-4此外，基于激光的系统。使用一个非共聚焦或光路。尽管这两个结果在这些平台的微阵列样品数字图像中，在构建这样的工具的设计选择，可以显着地影响系统的整体性能。
检测限，场均匀性和重现性的微阵列成像精度是最重要的指标，尤其是在发展中国家的诊断不确定性的余地不大。光传输，光收集和信号处理仪器子系统的设计都影响这些指标的表现。
荧光微阵列图像采集 激发光交货。在以激光为基础的系统中，一个单波长的激光束的直径为几微米的扫描背部和来回的样品，令人兴奋的一次单个像素的区域代表。发射光通过激励透镜行进，并收集由PMT表。PMT的每个光子的信号，然后将其转换成数字值，用于表示各像素位置处的信号强度，以创建一个图像进行放大。
在一个白色的光系统中，一种广谱如氙灯或水银灯的白光光源提供激励光。激发波长选择通过过滤的白光分解成更窄的波长范围内。在该指示灯点亮大面积的样品，并收集被一个固定的CCD阵列的整个视场的荧光发射。不同的时间，让收集到足够的光从样品中创建一个代表图像的CCD成像光圈打开。CCD阵列上的各像素位置处的信号强度，然后转换为数字图像。
激光照明集中在上面的样品表面的一个小点的高功率的单色光。更高的功率密度，可提供更多的光的荧光分子，因此，少得多的时间需要用过滤的白色光激发的染料比。由于激光束扫描样品，“住”在每个像素位置为几微秒。与此相反，一个白色光源照在样品上几秒钟或几分钟，而CCD集成在整个曝光时间发射信号。
发射光系列两个重要的检测器的特征，有助于系统的整体性能的线性范围和量子效率。线性范围表示的范围内的输入信号强度超过该检测器可以准确地测量变化，例如，一个给定的输入信号变化的程度会产生相同的输出信号的变化程度。通常指定为电流之间的差异的本底噪声和最高增益设置的线性范围内的PMT。例如，由滨松公司（新泽西州Bridgewater）滨松R3896 GenePix的微阵列扫描仪，用于在由：Axon仪器公司（盟市，加利福尼亚州）0.01-100μA，或四个数量级的范围内。从光电倍增管输出的信号被转换成一个16位的数字值，这意味着可分为216 = 65535步，覆盖约4.5个数量级的强度值。通过改变电压施加到它，这就决定了放大（增益）的信号作为电子穿过的PMT。4从光电倍增管输出的信号的幅度调整
光电倍增管具有一个最佳的工作的线性范围内，在其上信号的反应是最准确的。如果增益设置低于此范围，每个入射的光子将被转换成一个电子的概率降低了。超过这个范围，噪声开始干扰信号测量准确。对于滨松R3896，最佳的工作范围是从500到1000，V.如果在此范围内，信号与噪声之比的高，中，低强度的斑点的任何地方设置PMT增益不改变（参见图1）。用户可以在不同的电压扫描不同样品知道任何差异是由于生物效应，不扫描参数。例如，GenePix的扫描仪中的PMT可以测量信号的变化，在约4个数量级在任何给定的电压。 CCD检测器的线性范围内，指定作为CCD阵列上的各孔中读出的噪声电平（即，在每个像素中测量的波动，由于随机误差）的容量的比率。例如，常用的CCD阵列可能有井深20000电子（E-10，2000年的线性范围，或约三个量级）和读出噪声。
大多数生命科学成像中所用的CCD的12-bit数字分辨率可分为212 = 4096步，或约3.5个数量级的信号值。的CCD的信号强度范围内调整，通过改变曝光时间。喜欢一个PMT，CCD阵列也线性增加积分时间。然而，暗电流，或信号所产生的随机流过器件的电子在没有光的情况下，按比例增加随曝光和可能增加背景信号。
重要的是要注意，虽然一个CCD摄像机具有比线性范围较窄的光电倍增管，荧光染料分子的线性范围内的生物样品残留在所有的处理步骤之后很少超过2.5个数量级。对于大多数生物应用中，任一系统中的线性范围应该是合适的。为了充分利用在一个给定的图像的最大范围，亮点不饱和检测器的仪器设置在任一系统中应设置。如果一个系统演示线性的性能广泛的设置，用户可以选择一个单一的设置给定类型的所有芯片样品，从而消除变异的来源之一，更容易辨别哪些其他实验误差的来源和真实的生物学差异。
检测器的另一个重要特性是量子效率（QE），装置发射相对于它接收输入的光子信号的电子信号的措施。作为一个独立的组成部分，大部分使用的CCD芯片成像系统有大约比标准光电倍增管的双重更大??的QE。然而，在CCD和其它设计参数的12-bit数字分辨率的局限性，可以远大于的好处更大QE。例如，收集单个图像的显微镜载片上的大小足够大的CCD阵列是极其昂贵的。CCD成像系统捕捉多个图像的样品，然后将它们缝合在一起创建一个单一的形象。不精确的拼接，漂白，由于重叠区域和其他文物的多重曝光可以影响准确定量。过度拼接的另一种方法可能是使用了用于相机的镜头减少到一个较小的CCD表面的面积比较大的微阵列。然而，在所有的光学系统中，如果检测器是小于源，光收集效率的损失是不可避免的。
共聚焦与非共光学。基于激光的微阵列扫描仪，共聚焦非共光路设计可以使用。最初开发共聚焦光学图像薄切片厚的样品，例如细胞或组织（参见图3）。，5共焦光学系统创建一个很窄的焦点深度，拒绝信号从窄的焦平面超出。在不同深度的重复扫描创建多个高品质的光学部分可以改造成厚样品的3-D图像。与此相反，在微阵列上，大部分的背景从非特异性结合的滑动面，这是在同一平面上的焦点作为样品。芯片扫描共聚焦成像没有优势。可以使它们滑动或滑动架的平坦度的细微变化特别敏感，在共聚焦系统的聚焦深度的非常窄的。
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