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| 评估芯片荧光成像系统的性能特点 | |||
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选择单个组件，虽然是重要的，重要的是要认识到，仪器的性能取决于如何，所有的元素都整合成一个完整的工作系统。的电子电路，对应的光学元件，和移动部件的行为的所有影响的数据的质量。通过比较和量化的扫描图像，而不是简单地检讨各个组件的规格，性能表征应该总是做。
扫描仪校准。微阵列扫描仪等分析仪器必须执行一致，可以比较不同的结果，随着时间的推移。此外，多个相同类型的工具必须科学的结果可以验证，可以进行比较，以便产生数据。重复性特别是关键芯片成像仪由于上游化学和生物处理步骤产生显着的变化。事实上，实验可重复性仍然FDA批准用于诊断测试芯片的一个主要障碍。实验误差的来源和真实的变异生物更容易被隔离在一台扫描仪，有助于最小的额外变化。然而，机械，光学，电子元件的使用寿命是有限的，所以性能会改变，因为仪器老化。一个强大的校准程序，可确保随着时间的推移和多个扫描器之间的可重复性。
扫描仪校准需要一个已知的标准相匹配的仪器性能。这样的标准可能包括的荧光材料的吸收和发射光相对应的仪器可供选择的激发和发射频段。样品必须是光稳定的，这样它给出了相同的重复长时间的使用后的信号输出。例如，GenePix的扫描仪在出厂基准产生一个稳定的标准，使用定义的扫描设置指定的信号输出。仪器附带的测试标准，使用户可以按照定期校准程序随着时间的推移，重新调整到基准水平的仪器。多台仪器可以进行调节，以同样的方式，使得它们都产生基准信号电平，因此，在同一样品产生相同的信号输出。
检测限。关于荧光成像最常见的误解之一是，会有一个更光明的形象是一个更好的形象。不同类型和品牌的探测器，电子信号处理中的变化，模拟-数字转换器的分辨率，以及其他设计上的差异，会产生不同的绝对强度值对于一个给定的功能。此外，颜色映射，对比度设置，甚至显示器设置可以影响的表观亮度不同的图像。
检测限指定小信号系统可以精确量化，不只是最低的信号，这可能是显示器上可见。检测限是最可靠的测量信号噪声比（SNR）。6信噪比量化多么出色的系统可以解决信号从背景噪声中的利益。对于成像应用，信噪比计算公式为：
作为一个比喻，可以考虑寻找一个2米的高大的稻草人（信号）在麦田（背景）。如果所有的玉米秆1米高，则是平均背景低于的信号，和标准偏差（噪声）也低，所以稻草人将是清晰可见的。如果所有的玉米秆2米高时，则是平均背景相同的信号，虽然噪声仍然很低，稻草人将不可??见。最后，如??果高的玉米秆范围为0.5?3米多高，平均分配的平均背景为1.75米。背景是低于信号，但高度（即噪声）的变化将使其很难看到稻草人。
因此，对于成像应用中，平均本底水平和背景的标准偏差必须被包含在计算中。在许多信号检测学科作为样本值SNR = 3.6，7下面这一点，功能可能是肉眼可见的最小信号，可以准确量化的一个标准已建立，但准确量化能力显着减弱。
这是极其困难的一个绝对的标准量化的检出限为荧光染料，仅仅是因为许多染料敏感的环境条件，特别是光与年龄。为了使这样一个标准，用户必须量化荧光光谱仪上的样品中的染料被发现确切的摩尔量，附着到滑动时的特定的协议都在使用的溶液的体积，也知道。可以没有postspotting的洗涤或其他治疗，可能危及初步定量。即使有这样的精心准备，丝毫衰减信号可能会导致样品褪色低于检测极限。
然而，在实践中，与检出限的值附近的任何芯片可以被用于简单的扫描仪比较。要进行这样的测试，两个或两个以上的相同的样品应扫描在两个单独的工具，然后交换，并再次扫描正常化从在第一次扫描中的任何有害的影响（例如，光漂白）。SNR与低信号电平的一些相同的特征的比较，可以用来评估检出限的差异，即使绝对的染料浓度是不提供这些功能的。
场均匀性均匀成像领域，确保数据可以准确地比较来自不同领域的微阵列玻片上。一个主要的因素，决定场的均匀性是幻灯片本身。最标准的显微镜载物片被指定为约40μm的整个表面上的平整度，表示滑动可能具有高低至40微米的小山和山谷。这些表面的变化转化为定量的变化，特别是在景深的共聚焦系统，在该系统中，可能只有32-63微米。在这种系统中，样品表面会进来的重点，因为它扫描。à系统具有较大的景深非共可容纳滑动面的变化，以确保准确的集光，在整个扫描区域。微阵列的光学平面幻灯片市售。这些幻灯片的额外投资可能还清生产更多的可重复性的结果和更少的反复实验。
仪器的子系统，如支持的滑动表面，在成像过程中，控制样品的运动和/或激发源的组件，以及照明和收集光学场的均匀性都可以影响。在激光和白光的系统中，所有这些组件都必须精确地指定和对齐，以确保均匀的照明，在样品表面上的所有点处。
场均匀性的理想的标准来评价。将一个光学平面的滑动，被均匀地涂覆有一个稳定的荧光材料的薄膜。然而，为了描述正确的均匀分布的一种仪器，测试标准本身有更均匀的问题，以便不贡献其自己的非均匀性的测量仪器。尽管薄膜涂层技术是不是新的，所需要的均匀，稳定，荧光信号在显微镜幻灯片格式的标准尚未确定。
可以做一个合适的替代试验与任何荧光芯片。只需扫描阵列在一个方向，旋转180度，再次扫描，并比较相同点的信号强度在每个扫描。在第二次扫描的一贯较低的信号表明漂白。在任一方向的第三个扫描可以用来量化的漂白和减去其贡献的均匀分析。这种旋转测试场的均匀性是最可靠的措施，利用现有的工具。然而，它是有限的，是不对称的，相对于旋转的变化。例如，统一的山坡或山谷中间的幻灯片可能被发现。
图4。重复性测试GenePix的4000B。一个稳定的重复扫描荧光塑料材质，每天四次六天（红色通道，绿色通道500 V 700 V）。从幻灯片上的一个固定区域的信号的强度，计算相对荧光单位（RFU）。所有扫描之间的差异为1.6％，绿色通道和红色通道的2.1％。误差棒涵盖从四个测量值的平均值的两个标准devations（点击放大）。
从一个单一的芯片实验重现性。不能得出有意义的生物结论。用户是否有资源创造无限的自己设计的阵列，或购买预制阵列的，可重复的结果的数量减少昂贵的实验重复须制定统计学和生物学意义的结论。要确保可重复的结果，用户必须首先遵守推荐的预热时间和他们的仪器操作条件。特别是，激光器和白色光源需要的时间来稳定。此外，电子部件和运动部件可以容易受到极端温度和湿度的影响。
微阵列成像系统的输出信号的再现性，通过扫描一个稳定的荧光标准随着时间的推移在相同的扫描仪设置（参见图4），不可避免的长期信号漂移的最佳保险施加如上述的校准程序，可以进行测试。短期扫描到扫描的重现性，也可以测试与任何合理稳定的荧光样品，但由于光漂白的任何信号劣化，必须测量中减去。
结论
各个组件的规格使制造商能够定义他们所寻求的性能水平。然而，任何乐器的表现不取决于这些规格，但其整合成一个完整的系统功能。在微阵列的成像系统中，组件的质量，??设计的光学和电子学，和对应的所有元素确定最终图像的质量，定量精度和重现性。仔细定量从相同的样品的图像准确地比较不同的成像系统是唯一的方法。芯片界目前缺乏强大的定量测试标准评估关键的性能参数，必须凑合着用有限的替代品。行业领导者正在与美国国家标准与技术研究所（NIST）合作设计和开发荧光芯片测试标准。这些NIST可追踪工具将使制造商能够达到新的水平卓越的芯片扫描仪设计。
参考文献
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