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| 直接和间接ELISA各种类型的ELISAs | |||
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ELISAs可以分为直接的和间接的方法。 在一个直接ELISA,测定组件绑定到固体表面与酶标记二分析组件。 一般来说,直接ELISAs并不广泛使用,作为标记的抗原或抗体的主要耗时又昂贵。
在一个间接ELISA,检测是进行一个酶标记二次抗体。 首先,一个初级抗体与抗原。 在第二个孵化一步,一个标记二次抗体能识别主要抗体是用。 如果初级抗体来自同一物种被用在不同的化验,相同的酶标记二次抗体可以用于检测。 此外,灵敏度增加几个二级抗体可以绑定到一个主要抗体,导致信号放大。 各种各样的标记二次抗体是商业上可用。
三明治或捕获ELISA。 当抗原不能被直接绑定到固体表面的分子,因为他们的属性,一个三明治使用ELISA。 固体表面上涂上一种特定抗体用于捕获抗原。 因此,一个三明治ELISA有时被称为一个捕获ELISA。 在第二次免疫反应,另一种特定抗体是补充说,监测到一个酶标记二次抗体。 因此,抗原抗体之间的绑定两个。 对于一个三明治ELISA、抗原必须包含至少两个抗原,它允许并行绑定两个抗体。
竞争性ELISA。 如果分析物也太小了绑定两个不同的抗体或如果只有一个特定的抗体可用,一个竞争ELISA可能是首选的分析格式。 在一个竞争ELISA、标记和预滴定测定组件添加同时与样品。 如果抗原被绑定到固体表面,然后混合样品和添加标记抗体在孵化的一步。 包含在样本的抗体和酶标记抗体对抗原竞争结合。 更包含在样本的抗体,酶标记抗体可用少与抗原涂层。 减少的绑定标记抗体的结果在一个下降的信号。 另外,抗体可以绑定到表面,然后添加标记抗原与抗原竞争包含在样本在免疫反应。
间接ELISA协议。 下面的测试协议描述了一种间接ELISA在96孔聚苯乙烯高绑定微板块,基于吸附绑定的胰岛素的内表面井和随后的互动与一个特定的绑定胰岛素单克隆抗胰岛素抗体。 检测,一个反鼠标IgG-HRP共轭是使用。
涂层。 井充满了100?l涂料解决方案(800 ng / ml的胰岛素在0.05 M碳酸盐缓冲;pH值9.6)和存储在一个孵化器一夜之间(约18小时)在23°c。为了避免蒸发,培养皿中都充满了水,放在孵化器。 另外,这些盘子可以密封与板密封材料。
洗涤。 培养后,盘子都洗了四次350?l pbs t缓冲区(0.14 M氯化钠;0.01警察丁;0.05%二层20;pH值7.4)/好。 在最后一次洗涤步骤,液体完全被敲了板到纸毛巾。
阻塞。 未绑定的网站被屏蔽在表面与BSA的结合,避免在后续测定步骤。抗体 这些板块都充满了150?l /好阻止溶液(3% BSA在pbs t)和孵化60分钟的23°c .培养后,解决方案是手倾析。 剩下的液体被敲了板到纸毛巾。
添加主要抗体。 在免疫化学反应、抗胰岛素抗体(初级抗体)添加和绑定的胰岛素分子上。 这些板块都充满了100?l /好初级抗体溶液(80 ng / ml单克隆抗胰岛素抗体鼠标在pbs t)和在23°C孵化为60分钟。
洗涤。 飘散的抗体被冲走在随后的洗涤程序(重复洗涤步骤上面所描述的)。
增加二次抗体。 之间的相互作用检测胰岛素和特定的抗体,抗小鼠IgG-HRP共轭(二次抗体)使用。 这些板块都充满了100?l /良好的二次抗体溶液(300 ng / ml的抗小鼠免疫球蛋白g antibody-HRP共轭在pbs t)。 这些板块都在23°C孵化为60分钟。
洗涤。 重复洗涤步骤上面所描述的。
检测。 这些板块都充满了100?l /的衬底溶液(其中一部分3,3′,5,5’-tetramethylbenzidine(TMB)三个部分的柠檬酸/醋酸,每0.1米;pH值4.9)和在23°C的孵化20分钟。TMB被HRP,和一个蓝色的颜色被释放。 这个比色反应是停止和固定通过添加100?l 0.5米硫酸/嗯,这改变了蓝色的颜色黄色。 强度的反应和合成颜色是衡量一个微型板块读者在450海里。 颜色是稳定的最多一个小时,和板应该在此时间段内测量。
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