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| 膜厚度和血红蛋白结合位点的数量影响最小样本 | |||
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测试样品可以毛细血,静脉抽血的抗凝剂(通常EDTA),冷冻静脉血画在抗凝、和控制。 使用原型系统,85μL第一缓冲和55μL第二缓冲足以执行漂洗。 检测时间是大约五分钟。 在添加第一个缓冲区和阅读湿带空白,太长时间的延迟增加血液可以让太多的缓冲区传递,冲洗将不完整。 因此,血液样本应该添加在15秒的读取湿带反射。 时间的添加第二个缓冲区不是关键的检测方法提供了许多优点,包括以下:
在离子绑定步骤的分析,不仅超额血红蛋白是通过带但也冲洗其他不具约束力的元素在血液样本。 这就消除了可能的干扰物质从测量前区反射率测量是由。
血红蛋白绑定第一缓冲区将非糖化和糖化血红蛋白数量比例浓度在示例。 因此,改变数量的血红蛋白绑定第一缓冲区将导致一个比例变化在糖化血红蛋白绑定与第二缓冲。 变化总血红蛋白测量因此平行于糖化血红蛋白的变化测量。 使用的比率来计算糖化血红蛋白总量%糖化血红蛋白变化的影响消除。 脱到带变化由于组件和制造差异因此最小化。 这在图2中可以看到,它显示来自多个化验结果相同的样本。 浓度的变化总血红蛋白绑定在不同测定法是平行的浓度变化糖化血红蛋白。 结果的精度提供了在图2中说明的不精确比率是一个很多小于将预测从总和糖化血红蛋白测量不精确,如果这两个都是完全独立的。
两个总和糖化血红蛋白测定在同一位置的矩阵使用相同的光源和探测器。 两次测量之间的差异最小化,从而提高分析精度。膜是由只有共价束缚,带负电荷的羧基和boronate组和不包含任何不稳定的蛋白质或标记化合物。 膜本身是稳定不制冷,这使得它非常适合发展中国家使用。膜是测定唯一的活性组分,可以合并到一个数量的设计,可以是简单和廉价的,或更复杂的。
演示技术的可行性来衡量%糖化血红蛋白,它被纳入一个简单的试验系统。 检测系统的组成包括缓冲区(pH值6.5),缓冲B(pH值9.5),测试带,它存储在一个干的
(硅胶)瓶,一个涂布方便添加样品线的跨膜、手持系统的血糖计式反射计(名义430 nm领导;见图3)。测试条夹在表包含一个井被放置在结束时的膜带插入。 缓冲区被添加到这个好,流进膜。 测试条持有人还设计有插槽将两条腿的涂布和正确定位线包含样本到膜。
一个Porex横向弗洛膜与添加boronate团体准备如上所述,用于测试条的设计,利用横向流性质的膜(见图4)。膜坐落在一个塑料支架,反光层谎言在阅读区,吸收剂的缓冲和冲洗水槽收集血液。 缓冲区被添加的一端膜通过油井计,和血液样品添加只是下游的缓冲区。 缓冲移动样品通过膜到水槽在另一端。 绑定发生在整个膜,反射测试所使用的应用程序之间血液网站和水槽从一个洞里塑料支架。
组装测试带作为卡使用手册纹理过程。 丝带的不同组件被放置在塑料基板,这是预涂有粘合剂和预穿孔有破洞。 组件一起举行使用层的双贴胶带。 每个卡片生产50测试带,减少信用卡使用切纸机。 批次的5000测试带的都是用这个过程。
在原型系统分析,计测量反射率的总血红蛋白和糖化血红蛋白如上所述。 这些反射测量转换为血红蛋白浓度,并计算出糖化血红蛋白占总比率。 这个比率转换为参考%糖化血红蛋白值通过标准化比率%的结果参考法糖化血红蛋白。 参考方法用于研究下面描述的是一个boronate亲和力的高效液相色谱法都有其%的糖化血红蛋白检测结果标准化的糖尿病控制和并发症试验(DCCT)。
反射率和浓度之间的关系是非线性的,是由实验决定的类型的膜被使用。 样品用不同的血红蛋白浓度是通过膜条件下没有血红蛋白结合。 反射率测量是为每个浓度的样品流经测量面积。 浓度与反射率数据都配有一个四参数逻辑方程。 这个方程将反射率测量在试验(如。 ,在点A和B在图1)对应的血红蛋白浓度值。
糖化血红蛋白浓度(B点测量)除以总血红蛋白浓度(点测量)获得糖化血红蛋白,血红蛋白总量比例。 这个比率是线性相关的糖化血红蛋白浓度测定的参考方法(参见图5)。图5显示了从多个分析获得的数据的五个病人的血液样本。 这种线性关系(斜率和截距)转换比率来引用%糖化血红蛋白值。
技术的性能进行了研究使用原型系统。 这项研究包括比较分析结果参考方法,测量测定精度,确定测定线性,确定使用温度应力试验片的稳定性。结果从化验血样使用原型系统的分析比较结果相同的样品使用NGSP二级参考方法。 提供了一种方法标准化NGSP糖化血红蛋白检测结果,建立了两个研究糖化血红蛋白浓度之间的关系和长期问题在糖尿病患者:DCCT和英国前瞻性糖尿病研究表明)。 NGSP集的标准比较测试结果从新技术参考方法测试结果,基于偏差之间的两组结果。 测试方法是在满足认证标准。
冻全血样品从四十患者获得来自密苏里大学的,一个主要的参考实验室NGSP。 这些样本化验的boronate绑定高效液相色谱法,使用作为一个次要NGSP参考方法。 然后他们被重复使用中化验原型系统。 样品的范围从5%到11%的糖化血红蛋白糖化血红蛋白,与9之间5%和6%,七6%和7%之间,和二十四在7%和11%之间。
最小二乘法回归分析的结果从化验使用原型系统与参考方法的结果给了一个回归公式,Y = 1.21 X - 0.12,Y是原型糖化血红蛋白和糖化血红蛋白X是参考。 统计分析表明,边坡是1(P = 0.394)和拦截是0(P = 0.397)。 相关系数R2为0.971,表明%糖化血红蛋白结果使用原型试验证明一个好相关的结果使用的参考方法。 图6显示了偏压情节原型之间的化验结果和参考方法测定结果。 95%的置信区间范围的偏差结果落在2011 NGSP标准认证的可跟踪性,研究结果表明DCCT。
原型系统的精度测量结果的多个化验的静脉血样本(储存在4°C),它是由两个运营商使用两个很多带了两天。 每个操作员每天跑八化验对每个批次(32总化验对每个批次)。 总体结果一是意味着很多% 5.2的糖化血红蛋白与3.1%的简历。 结果两人一个意味着很多5.4的糖化血红蛋白与% 2.8%的简历。 一个双向方差分析的数据显示没有统计上显著的日常变化(P = 0.238)或操作员算子变异(P = 0.238)。
线性度的测定是证明了结果的分析外加剂的正常和高架控制。 结果证明了分析有一个线性响应到至少16%的糖化血红蛋白和精度是一致的在线性范围(见表)。
膜的稳定性是决定通过将测试条虽然一个加速老化过程和存储他们处于高温45°c(早先的研究表明,离子的结合血红蛋白的膜是影响膜的接触到75%相对湿度持续一段时间。 测试条因此储存在封闭瓶含有硅胶干燥剂)。 化验的静脉血样本,在aliquots冷冻贮藏进行在不同存储间隔和使用一个新瓶每个时间。 测试带,被储存在室温下也用于测定血液在每个存储间隔作为控制可能的变化随着时间的血液样本。 图7提供了糖化血红蛋白测定结果的百分比不同存储间隔为两套带。
比一天零结果,分析结果证明没有证据表明在45°测试条衰减测量糖化血红蛋白C %至少365天。 测试条45°C提供存储在相同的结果作为室温存储条在每个存储间隔。 结果从这些化验还显示,没有腐烂在总血红蛋白绑定或糖化血红蛋白绑定在要么温度为365天。 这证明了带负电荷的团体和boronate团体保持它们的功能在两个期间的温度贮存时间。
初步结果表明,血红蛋白测试可能的干扰物HbAE变体,广告,交流,因为,胆红素、脂血化验结果没有改变。 预计将会有小的干涉,因为大多数洗血的成分通过阅读区域进行采样测量之前。 化合物不仅必须绑定但也吸收光线的测量波长为了干扰直接。 此外,任何降低绑定的总血红蛋白会相应减少并行降低糖化血红蛋白由于使用的比率来计算%糖化血红蛋白。
结论
使用所述绑定技术,它有可能开发出一种低成本的糖化血红蛋白的检测系统。 该系统可以利用手持反射仪测量。 的化学修饰膜是稳定的,它允许系统有足够的稳定,不制冷。 因此,可以开发一个相对低成本的系统,可以用于在发展中国家。 这项技术也可以被纳入更复杂的系统,即时使用。
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