购买时请注意选择相应的产品名称
| 阻断策略在酶联免疫测定中使用的尼龙膜 | |||
|---|---|---|---|
|
在膜为基础的酶联免疫吸附系统，灵敏度，背景和信号强度的发展是首要关心的问题。这些参数包括：受开发者的选择膜，阻断策略，抗体浓度，酶和底物。所有这些因素是相互关联的。来确定膜的化学和阻断策略的影响，测定的开发常规转向的原料和试剂的制造商。
尼龙膜通常用于ELISA的应用，并且可与多种表面化学组成。由于在选择表面化学，仔细注意阻断策略需要达到最好的效果。斑点印迹实验中，在其中多个变量被操纵以简单的矩阵形式，可以快速引导开发者的表面状况的最佳结合，阻断浓度和试剂。本文介绍的模型分析系统和实验，可用于优化膜的选择和阻塞。
背景
基于膜的酶联免疫吸附测试通常配置为在其中一个膜压靠在吸湿垫和溶液被输送到膜的上表面流过的装置。1的初级抗体结合到膜的表面，这是然后封锁，以防止非特异性结合。被分析物是在一个测试溶液，它可以是一个缓冲或体液。第二抗体，缀合到一种酶，可以是直接添加到测试溶液或在分析物后的一个单独步骤。以产生信号，洗涤膜并孵育色形成的基板。
许多ELISA试验中使用的尼龙膜作为支撑基体。24除了它们的两性（未修饰的）的形式，尼龙膜，可在形式与各种表面化学性质，包括那些具有氨基和羧基基团，季铵基，羧基和羟基的，而对于共价活性基团结合。显影剂的选择膜的应根据经验确定，根据它如何好与其他所有测试试剂相互作用。
要获得良好的测试结果，关键是要阻断可在膜的任何非特异性结合位点。58使用封闭剂的正确类型和数量是重要的;阻塞不足可能导致高背景，而过度封锁可能会降低灵敏度。该封端剂通常用于硝化纤维素或聚苯乙烯微孔板，如牛血清白蛋白（BSA）和鱼明胶，都不能有效地阻断尼龙膜上。虽然干牛奶配方是用于与尼龙膜使用流行的选择，最有效的阻挡制剂可用于所有类型的膜是Hammersten同类酪蛋白的溶液中，在0.05?0.5％在缓冲液中使用的，与表面活性剂的低浓度在一起。
初级和次级抗体浓度的平衡也可能会影响测定。的灵敏度和背景912，例如，增加，以达到更高的灵敏度的二次抗体的酶的浓度也可导致较高的背景。系统的性能也会受到影响由开发者选择的酶底物，13与快速发展时期的基材可能会导致更高的背景水平比一个有发展缓慢的时间。
开发一种新的测定时，所有这些因素都必须考虑到，任何测定系统总是需要的灵敏度和背景（选择性）之间的平衡。以优化测定法的性能，可以将变量矩阵变换以简单的斑点印迹实验。只有少数实验需要确定在此过程中的每个步骤尽可能好的条件。
方法
模型酶联免疫吸附系统。一个模型的夹心ELISA系统，使用山羊抗兔IgG抗体作为第一抗体（R2004，Sigma化学公司，St.Louis），兔antigoat IgG作为抗原（G4018，Sigma）的设计，并且羊抗兔IgG的缀合至过氧化物酶（A0545， Sigma公司）作为第二抗体。底物溶液包括0.1毫克/毫升diaminobenzidene，1毫克/毫升咪唑和0.03％的H 2 ? 2（全部购自Sigma）。膜是由颇尔公司（东山，纽约州）提供。阻断剂包括牛血清白蛋白，明胶（Sigma）和Hammersten同类酪蛋白（Gallard施莱辛格，韦斯特伯里，NY）。
使用移液器，初级抗体为1?100毫微克的稀释液应用到膜卡作为1微升的斑点。将膜在空气中干燥5分钟，并阻断与下列之一：
5％BSA / PBS。
5％的明胶/ PBS中。
0.1％的Hammersten同类酪蛋白，0.05％吐温20。
0.5％的Hammersten同类酪蛋白，0.05％吐温20。
膜浸入封闭液在室温下30分钟。封闭后，将膜孵育100毫微克/毫升抗原的10分钟。膜用封闭液短暂洗涤，然后与一个1/500稀释的偶联物10分钟。膜洗涤3次，每次洗涤2分钟，用0.??1％吐温20/water然后孵育2分钟的底物溶液。将膜在水中漂洗，并在空气中干燥。
免疫检测地高辛标记的DNA探针。 的LAMBDA的HindⅢDNA（含1毫微克至1皮克/微升）稀释物点到尼龙膜上。的点进行空气干燥15分钟。为的Biodyne乙膜，DNA固定烘烤;对于所有其他的膜，DNA是通过暴露于紫外光固定（3分钟，手持式光源，Mineralight R52G，6英寸）。在膜上的DNA通过使用地高辛标记的探针，并antidigoxigenin抗体缀合至碱性磷酸酶，用BCIP / NBT底物（天才试剂盒，Boehringer Mannheim公司，阿灵顿，IL）进行检测。不同的封闭剂（无块，BSA，宝灵曼阻断剂，或Hammersten级酪蛋白）均在预杂交，杂交和阻断步骤中添加。膜按试剂盒说明书进行处理。
|
| 上一篇：诊断测试和化验使用微球基板或支持基于免疫 | 下一篇：对于实验室的芯片来说未来是塑料制造的 |
|---|
无法在这个位置找到： xy/left.htm