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| 影响中空纤维生物反应器抗体生产效率的因素 | |||
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10000他的生产效率-并使用左旋公司，Acusyst小和Unisyn科技公司30,000兆瓦截止中空纤维生物反应器盒，CP2000的生物反应器系统进行了研究。两个墨盒的类型产生显著数量的小鼠单克隆抗体，但生产效率（毫克抗体每升培养基中消耗的制造）更高的30000兆瓦墨盒。此外，较小的孔径盒抗体生产和26至33天与11?20天为30,000兆瓦盒细胞生长所显示的延长滞后期。高内毛细管介质的进料速率（5.0升/天为30,000 MW和8.4升/天为10,000 MW）可能会降低整体抗体的生产效率，并降低进料速率（3.5和7.2升/天，分别）可能每升产生更多的抗体介质消耗。
从汇合的生物反应器滤芯的定期除去过量的细胞可以增加抗体的产生和扩展的游程的长度。抗体的批量收获可能会导致更多的高浓缩抗体比连续收获。
使用中空纤维筒作为基质用于杂交瘤细胞生长的生物反应器系统的生产单克隆抗体的multigram量的有效方法。13的空心纤维筒可产生从污染的细胞或血清蛋白的高度浓缩的单克隆抗体相对自由。4这些墨盒，可主要在10,000（如肾透析盒）分子量孔径或只在生物反应器系统生产的大孔径的配置。
使用左旋公司（明尼阿波利斯），Acusyst小和Unisyn Technologies公司（加利福尼亚州Tustin），CP2000生物反应器系统中，我们调查了几种类型的中空纤维筒的维持小鼠杂交瘤细胞的生长的能力和，以产生抗体。我们还研究了几个关键的运行参数，包括中等进给率，抗体收获方法，细胞去除，和葡萄糖利用率（GUR）对抗体产生的影响。
材料和方法
细胞系。鼠杂交瘤VA1 18D7.3.2.4（antivalproic酸）（IgG1的），铁道部9B1（antimorphine）（IgG1的），METH7-4B6（IGA）（antimethamphetamine），和PCP1.9D10（IgG1的）（antiphencyclidine）生长在Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（IMDM）（敏达公司，赫恩登，VA），补充有2mM L-谷氨酰胺（Gibco公司，格兰德岛，NY）和10％胎牛血清（FBS）（Hyclone公司实验室，洛根，犹他州） 。采用国家统计局融合伙伴生成所有的杂交瘤。
基线静态培养生产率对于每种细胞系，建立了5×10重复播种4个细胞/在生长培养基（如上所述），在标准的T25烧瓶毫升（康宁，康宁，纽约州）。将培养瓶置于37℃，7％CO 2 72小时，然后除去培养基，并以1000rpm离心10分钟。得到的上清液中测定总的和特异性免疫球蛋白通过ELISA（表I），如于下文中描述的“抗体浓度的测定。” （表尚未公布上线。）
生物反应器系统和中空纤维筒。的Acusyst Jr。被用Acucell 1100（左旋，Inc。）的10,000兆瓦墨盒表面面积的19呎和120毫升毛细管外空间（ECS）（表一）中运行。墨盒采用了逆流循环过程，以积极地输送介质来回的内毛细管（ICS）和ECS之间。该系统是独特的Acusyst Jr。和其cultureware并且是不可用于测试的其他墨盒或系统。
CP2000的比较采用其他两种10,000兆瓦墨盒：本Clirans T220铜氨纤维肾透析盒（19平方英尺的面积，100毫升ECS）（Terumo Corp。制造，新泽西州Somerset）和BR2010两性共聚物膜墨盒（35平方英尺的面积，210毫升ECS）（Unisyn技术公司，加利福尼亚州Tustin）。这些也较BR3530醋酸纤维素30000兆瓦的生物反应器，从Unisyn技术暗盒公司（表I）。
一般生物反应器的运行参数。的小鼠杂交瘤培养物中的IMDM制剂。在对数生长期（> 85％存活通过台盼蓝排除法）离心细胞，在400×g离心5分钟，然后在新鲜的生长培养基中重悬。约10 9则细胞被引入到每一个生物反应器筒的精英由一个大的注射器。
中空纤维生物反应器中进行了墨盒的两个生物反应器系统与如上所述的IMDM测试。FBS的浓度在ICS介质的所有生物反应器实验中，除了那些使用铁道部9B1和PCP1.9D10分别为3％，第20公升的媒体和1％，为余下的实验。在ICS中的MOR 9B1和PCP1.9D10运行的FBS浓度为3％在整个实验过程中。血清浓度为MOR 9B1和PCP1.9D10实验贯穿保??持在10％以上。对ECS的FBS浓度为其他细胞系中逐渐从10到1％通过引入ICS料培养基整个实验过程中降低。
每个生物反应器运行的运行参数进行操纵，以最大限度地提高生产力。他们根据细胞系，生物反应器系统，以及生物反应器中盒的要求而变化。最初的毛细血管内再循环率对于每个CP2000运行的范围350和550毫升/分钟之间，并逐渐增加至999毫升/分钟的最大设定值。该Acusyst小的再循环率为200至400毫升/分钟。它不能用，因为泵系统限制的再循环率> 400 ml / min的运行。温度自动地由这两个系统，在37±0.5℃下维持 在100％空气和二氧化碳的流速分别保持在约100和510厘米3 /分钟，分别贯穿每个CP2000运行的过程。pH值对运行6.9和7.3之间不等。
的葡萄糖利用率的测定。的GUR是细胞代谢和细胞生长的指示剂。5的墨盒，以维持细胞的生长的相对能力，通过测定葡萄糖的量由所用的细胞在ICS评估。在循环生物反应器的ICS培养基葡萄糖浓度用罗氏血糖试剂与罗氏校准的血清对COBAS生物仪器（全部来自罗氏诊断系统公司，萨默维尔，新泽西州）确定。
具有低古尔生物反应器可能有太少代谢活跃的细胞表现出足够的抗体产生。高GUR可以导致剧烈的过度生长和过早衰老。我们，因此，建立一个目标GUR为不同的生物反应器配置。在目标GUR，运行参数，如介质的进给率和再循环率进行了优化，以最大限度地提高抗体的产生。目标GUR是通过在不同介质中的进给速率增长的每一个细胞系实验来确定的，它依赖于细胞系和墨盒。250毫克/小时的目标GUR每个生物反应器体系的建立。
的GUR（表示为mg /小时），通过下式确定：
GUR = {进给速度（毫升/小时）×[葡萄糖（毫克/升）葡萄糖满分（毫克/升）]} / 1000
其中葡萄糖在葡萄糖是在进入生物反应器系统中的补料培养基的浓度，和葡萄糖，满分为葡萄糖的再循环介质中的浓度。
抗体浓度的测定。分泌抗体的生物反应器系统中的浓度用ELISA测定。九十六个孔 ??微量滴定板（Costar公司，剑桥，MA），预先涂有drugbovine血清白蛋白（BSA）的结合物被封锁以防止与在磷酸盐缓冲盐水（PBS）/叠氮化物1％BSA的非特异性结合。培养上清的系列稀释液从生物反应器ECS绘制被应用到特定的板，并通过将已知浓度的纯化抗体在上板平行孔中产生的标准曲线进行定量测定。
将样品和标准品的孵育后，未结合的抗体除去洗涤该板在PBS /吐温20（Sigma公司生物化学试剂，圣路易斯）。结合的抗体，通过加入碱的检测phosphataselabeled抗鼠抗体（Zymed公司，旧金山）。抗体的浓度在405nm处有一个CR340板读数器（SLT公司，奥地利萨尔茨堡）用分光光度计测量，并使用ELISA 3.0版计算机软件（Meddata公司，纽约市）进行数据分析。
标准细胞生长和抗体产生，抗体的产生和细胞生长的Clirans T220，BR2010，以及Acucell 1100中空纤维筒的比率进行了比较，那些Unisyn BR3530墨盒。为了保持一致性，分别用于运行之间的比较武断的标准。一个准则是达到250毫克/小时的目标GUR水平所需的天数;另一个是需要产生1克抗体的天数。这些标准定义的滞后期在不同墨盒或不同的细胞系或一个给定的墨盒条件下生长的相同细胞系的比较。
孔径对抗体产生的影响通过抗体的产生量（单位为毫克）的测定每升ICS的测定饲料介质消耗过一段时间（生产效率）。由于运行在不同时间，40天是任意选择的是代表每次运行。最后一个标准是由运行40天产生（克）总的抗体。
使用VA1 18D7细胞系，我们比较了抗体的产生和细胞生长中使用Clirans T220（泰尔茂株式会社制造，萨默塞特，新泽西州）中，BR3530，并且BR2010（Unisyn Technologies公司）的生物反应器的CP2000生物反应器系统的速率墨盒。在MOR 9B1细胞系用于将Acusyst小的生物反应器系统和Acucell 1100墨盒抗体产生和细胞生长中的CP2000生物反应器系统使用BR3530盒（表I）的比率进行比较。
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