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| 试验亚硝酸盐的测定需要用到的试剂仪器及方法 | |||
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亚硝酸盐(防腐剂、护色剂)用于肉类制品作发色剂，肉制品由于使用亚硝酸盐而呈红色，亚硝酸盐也是一种防腐剂，它可抑制微生物的增殖。1967年珀里戈等发现：仅用亚硝酸钠时，100 mg／kg才能对肉毒梭状芽孢菌起抑制作用，而若用亚硝酸钠的同时并加热，仅需3．5 mg／kg即可抑制。硝酸盐可与2，4一间二甲苯酚或二磺酸酚作用形成黄色化合物，硝酸根可硝化苯形成硝基苯，等等；亚硝酸根可重氮氧化后偶联显色；而亚硝酸根和硝酸根又可经氧化、还原互相转化。利用这些性质即可进行比色法或气相色谱法等的硝酸盐或亚硝酸盐测定。目前普遍用于食品中痕量测定的是重氮偶合(格里斯试剂)比色法。
1．原理样品经去脂肪、蛋白处理后，在弱酸条件下亚硝酸盐与氨基苯磺酸重氮化后，再与N—1萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，根据染料颜色的深浅与标准比色定量。
2．仪器①分光光度计。②小型绞碎机。
3．试剂①亚铁氰化钾溶液：称取10．6 g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，用水溶解并稀释至100 mL。 ②乙酸锌溶液：称取21．9 g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]溶于少量水中，加入3 mL冰乙酸，加水稀释至100 mL。③饱和硼砂溶液：称取5 g硼酸钠(Na2 B4O7·10H2O)，溶于100 mL热水中，冷却后备用。④对氨基苯磷酸溶液(4 g·L-1)：称取0．4 g对氨基苯磺酸，溶于100 mL (1+4)盐酸中，避光保存。⑤盐酸萘乙二胺溶液(2 g·L-1)：称取0．2 g盐酸萘乙二胺，溶于100 mL水中，避光保存。 ⑥亚硝酸钠标准贮备液：精密称取0．1000 g亚硝酸钠(于硅胶干燥器中干燥24 h)，加水溶解后移入500 mL容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于200?g亚硝酸钠。 ⑦亚硝酸钠标准使用液：临用前，吸取亚硝酸钠标准贮备液5．00 mL。置于200 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于5?g亚硝酸钠。
4．样品处理①肉制品(红烧类除外)：称取经搅拌混合均匀的样品5 g于50 mL烧杯中，加人硼砂饱和溶液12．5 mL，以玻璃棒搅和，继以70℃左右的重蒸水约300 mL，将其冲洗人500 mL容量瓶中，置于沸水浴中加热15 min，取出，一面转动，一面滴加2．5 mL醋酸锌溶液，以沉淀蛋白质。冷却到室温，用重蒸水定容到刻度，摇匀，放置片刻，撇去上层脂肪，清液用滤纸过滤，滤液必须清澈，留作亚硝酸盐和硝酸盐的测定。②红烧类：前面部分操作步骤与肉制品相同。取其滤液60 mL于100 mL容量瓶中，加氢氧化铝乳液至刻度，过滤，滤液应无色透明。 ③果蔬类：样品用组织捣碎机打浆。称取适量浆液(视试样中硝酸盐含量而定，如青刀豆取10 g，桃子、菠萝取30 g)，置于500 mL容量瓶中。加200 mL水，摇匀，再加1.0 mL果蔬提取剂(如滤液有白色悬浮物，可适当减少)。振摇1 h，加2．5 mol·L -1氢氧化钠溶液40 mL，用蒸馏水定容后立即过滤。然后取60 mL滤液于100 mL容量瓶中，加氢氧化铝液至刻度。用滤纸过滤，滤液应无色透明。
5．测定①亚硝酸钠标准曲线的绘制：用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液(5 ?g／mL)0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、l. 0、1．5、2．0、2．5、3．0、4．0和5．0 mL (各含0、1、2、3、4、5、7．5、10、12．5、20和25?g亚硝酸钠)分别加于一组50 mL容量瓶中。各加2 mL0．4％对氨基苯磺酸溶液，摇匀。静置3～5 min后，加人1 mL0．2％萘基盐酸二氨基乙烯溶液，并用重蒸水定容到50 mL，摇匀，静置15 min后，于2cm比色皿，用分光光度计在540 nm波长下测定吸光度。绘制标准曲线。
②亚硝酸盐的测定：取40 mL滤液于50 mL容量瓶中，加入2 mL0．4％对氨基苯磺酸溶液，静置3～5 min后，加人1 mL0．2％萘基盐酸二氨基乙烯溶液，并用重蒸水定容，摇匀，静置15 min。测吸光度，从标准曲线上查得相应的硝酸钠浓度(?g／mL)，计算试样中亚硝酸盐(以亚硝酸钠计)的含量。
6．计算① X=A/{m*[40/(500*50)]}式中：X——肉制品中亚硝酸盐含量，, ?g· g -1；A——测得的吸光度在标准曲线上对应的亚硝酸钠浓度，?g·mL -1；m——样品质量，g。
② X=A/{m*(60/500}*[40/(500*50)]}式中：X——红烧类和果蔬类中蛸酸盐含量，?g·g-1A——测得的吸先度在标准曲线上对应皆多亚硝酸钠浓度，?g·mL-1；m——样品质量，g。
硝酸盐的测定提要：使硝酸盐溶液通过镉柱，则硝酸盐还原成亚硝酸盐，然后按硝酸盐的测定方法测定。测硝酸盐时，滤液进入镉桂前，须先以25 mL(1：9)稀氨缓冲溶液流洗，其流速可控制在3～5 mL／min(简易镉柱前控制在2～3 mL／min)。当氨液流完后，吸取20 mL试样滤液置于50 mL烧杯中，加5啦氨性缓冲溶液，混合后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原用烧杯收集流出液。当贮液漏斗中样液流完后，接着加入5 mL水置换出柱内留存的样液。如前将全部收集液流进镉柱再还原一次：。堞二次流出液收集于100 mL容量瓶中，继以重蒸水流经镉柱洗涤3次，每次20 mL。洗涤液一并收集于同一容量瓶中，用重蒸水定容至刻度。 摇匀，取出10~40 mL(视滤液中含亚硝酸盐量而定)于50 mL容量瓶中；如前进行显色和测定，可求得样品中经还原后亚硝酸盐总含量，减除原有的亚硝酸盐含量，再乘以从亚硝酸盐换算到硝酸盐的系数，就得剧试样中的硝酸盐含量。
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