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| 随机扩增多态性DNA技术显著的优点 | |||
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| RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。90年代前期RAPD技术得到广泛的应用，几乎所有的作物都有这方面的研究报告。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷，并对此作了一些探索。RAPD技术目前运用相当广泛，几乎渗透于整个基因组研究的各个方面，这与它所具有的众多优势是分不开的。 RAPD显著的优点：在对基因组序列一无所知的情况下分析微生物DNA的多态性；方法简单快速和高度的重复性使其很快普及应用。 其原理为：采用核苷酸序列的随机引物进行基因组DNA扩增，非特异性引物可以结合在模板DNA的多个位点，产生多个PCR产物，采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离开，将每株菌在每条引物下扩增后产生的图谱合成为针对一株菌的单一图谱，再通过软件进行分析。 方法上基本分三个步骤：①基因组DNA的制备；②PCR引物的选择和AP-PCR；③聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳分离AP-PCR产物。 (1)模板DNA的制备 RAPD只需要极少量的DNA作模板，对DNA提取的质量要求也不高，一般通过酚/氯仿提取即可。模板量从25pg～l0ng均可以观察到多态性带。这为那些还无法离体培养大量繁殖的物种的分子标记提供了可能。 (2)随机引物的选择 研究物种不同，对引物并无要求。根据生产厂家、(G+C)含量不同等分成多个序列。高(G+C)含量的引物扩增谱带是其他引物的2倍多，但多态性的分子标记结果是一样的。 (3)影响AP--PCR的关键技术因素 ①PCR的退火温度可能影响带谱的特异性和重复性，但其影响程度取决于引物的长度。引物长时影响不大，可使用高温退火；引物短时影响大，因而退火温度要低，以保证引物与模板的结合。②模板的浓度对PCR产物有影响，DNA的模板浓度以30pg～7.5ng为宜，10pg是低限。③AP-PCR引物不需特异选择，尤其当用于种的鉴定时，但不同序列的引物扩增的PCR多态性不同，尤其是种或株特异性的DNA片段。 RAPD技术简便易行、省时省力，不需要RFLP分析的预备性工作：如克隆的制备、同位素标记、Southern印记反应及分子杂交。RAPD易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析；⑤RAPD分析所需的DNA样品量极少，仅为RFLP的1ö1000-1ö200，这对于生物早期取样鉴定或在DNA受限制的情况下是十分有利的。 |
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